一、背景周围神经损伤和缺损的治疗是显微外科的难题之一,神经缺损修复,尤其是长段周围神经缺损的重建仍是当前临床医学面临的一个难题,目前尚缺乏有效地治疗手段,一直以来自体神经移植是修复周围神经缺损最理想的手术方法,在临床上已广泛应用,也是衡量各种神经桥接材料的“金标准”。但往往会造成供体神经支配区感觉、功能障碍,且自体神经来源有限,因而临床上迫切需要更安全有效的治疗策略。近年来组织工程化神经为提高长节段周围神经缺损的修复带来了新希望,因此,众多学者不断探寻用其他移植材料来修复神经缺损,如何模拟神经再生的微环境,选择合适的支架材料,充分发挥神经营养因子和种子细胞的趋化作用,构建出复合型神经导管以支持长距离神经缺损修复,是目前的研究热点。二、目的本课题研究从仿生设计的角度考虑,首先以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础,设计并制备了RGD多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)(简称PRGD),然后综合PRGD、聚乳酸(PDLLA)、β-磷酸三钙(β-TCP)几种材料优点将它们制成含有神经生长因子的复合型神经导管,通过体外生物学评价和动物实验评估其用于修复大动物长段周围神经缺损的可能性,并初步用于临床,评价其修复周围神经缺损效果。三、方法1、从仿生设计的角度考虑,首先以神经基底膜结构与组成的分析研究为基础,设计并合成了RGD多肽接枝的高分子聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)(简称PRGD),以乙酸乙酯为溶剂,分别加入聚乳酸(PDLLA).β-磷酸三钙(β-TCP)以及微量神经生长因子(NGF),经超声波分散,磁力搅拌,采用溶剂挥发法制备PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管。2、采用直接接触法将材料与RSC96细胞共培养,研究PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF(?)申经导管与雪旺细胞的相容性。扫描电镜下观察细胞在材料表面的黏附与铺展情况,用ELISA法对复合材料NGF缓释性能进行测定,并绘制复合材料的NGF释放曲线。3、健康成年杂种犬12只,双侧后肢建立30mm腓神经缺损模型,左后肢用新型人工神经导管进行桥接修复,右后肢用自体神经移植修复,术后分笼喂养,观察切口愈合情况及步态。4、术后3、6、9个月分别在导管组实验侧小腿胫前取胫骨前肌肌纤维,对靶肌肉石蜡包埋行HE染色进行组织学观察,术后9个月在麻醉下对双侧肢体行神经电生理检查,记录潜伏期、波幅并计算神经传导速度,分批处死动物,对再生神经及靶肌肉进行组织学检查,最后处死动物取双侧肢体再生的腓总神经标本,分别行石蜡包埋和树脂包埋,分别在光镜和电镜下对移植段神经进行组织形态学观察及超微结构测定。术后第9个月时将体内神经导管材料取出,观察其大体形态,表面血管化及组织生长情况,扫描电镜观察分析导管微观结构变化。5、在大量动物实验基础上,制定了产品注册标准,并通过了国家医疗器械天津检测中心的检测后,应用可吸收诱导神经修复材料修复人类粗大周围神经缺损,术后2周、1个月、3个月、6个月规律随访,观察神经功能恢复情况。四、结果1、成功制备出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管,外观呈乳白色,无嗅,无味。材料表面光滑、无裂纹、无毛刺,质地柔软,可折弯,易于缝合。体外培养与RSC96细胞具有较好的细胞亲和性,并可持续释放NGF30天以上。2、动物实验术后大体观察：术后2周患肢足背出现不同程度红肿、溃疡,一月后伤口自行愈合。术后患肢即出现明显背伸活动受限,小腿胫骨前肌逐渐萎缩。手术切口处均I期愈合,局部无红肿、渗液,无异物反应。术后3个月时小腿胫骨前肌萎缩的肌肉开始恢复。3、电生理检测：术后9个月刺激神经干,记录能引起各组动作电位的潜伏期、波幅并计算出传导速度。术后9个月双侧均可引出复合肌动作电位。导管组与自体组比较传导速度及潜伏期无显著性差异(P>0.05)。4、组织形态学观察：导管组胫骨前肌术后3、6、9个月标本HE染色见术后3个月时肌纤维直径明显变小,细胞核多,染色反应增强,肌束间见较多结缔组织,3个月后萎缩的肌纤维逐渐开始恢复。术后9个月导管内有连续性再生神经组织通过,再生神经饱满,表面可见营养血管爬行生长。亚甲蓝髓鞘染色：再生神经近端：神经纤维分布均匀,密度较前增加,髓鞘增厚；中端：再生神经形成大小不等神经束,神经束内可见分隔,髓鞘较薄,其间有丰富结缔组织；远端：神经纤维呈区域分散状,形态较规则,髓鞘较薄。图像定量分析：导管组与自体组两组有髓神经纤维轴突直径、髓鞘厚度相比较均无显著性差异(P>0.05),差异均无统计学意义。透射电子显微镜下超微结构见术后9个月时再生神经远、近、中端均可见成熟神经纤维,髓鞘厚,轴突增粗,形态较成熟,髓鞘板层清晰,微丝微管丰富,偶可见雪旺细胞包绕轴突,可见部分无髓神经纤维散在分布。5、临床试验随访结果：术后所有患者伤口均I/甲愈合,无局部炎症、过敏症状(局部红肿、皮疹、瘙痒)。生命征平稳,血常规、肝肾功能、血沉、C反应蛋白等均未见有临床意义的数值,无相关不良反应事件发生。肌电图检查：术后3个月于支配肌肉即可记录到再生信号,部分感觉神经传导功能恢复正常,至第6个月时肢体能恢复部分运动功能,初步应用近期效果令人满意。五、结论1、通过对天然神经基底膜成分的仿生,成功制备出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管,体外实验表明该材料具有良好的生物相容性和细胞亲和性,并能持续释放NGF达30天。2、PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合神经导管能成功修复犬长段周围神经缺损,修复效果与自体神经移植相近。3、将PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管进行初步临床试用研究,对3例周围神经缺损患者进行神经导管修复,近期观察具有良好神经修复性能,远期效果还有待进一步观察。