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大多数柑橘的单粒种子中合子胚与珠心胚共存,称为柑橘种子特有的多胚现象。多胚性遗传稳定,是繁殖整齐一致的砧木的前提,也是柑橘常规杂交育种的主要障碍。已有研究表明,柑橘的珠心胚起始于胚囊周围的珠心细胞。然而,由于取材限制,大部分研究以均质胚珠作为研究对象。并没有考虑到不同细胞类型的特异性问题,对珠心胚起始发生机制认识还相当有限。激光显微切割(Laser Microdissection,LMD)是一种精确取样技术,在显微镜下精确定位目标组织和细胞,利用激光束从组织切片中快速切割、收集目标组织或细胞用于大分子物质的提取。该技术简便、易行准确度高,已成功的运用于动植物研究,使得分离出珠心胚起始细胞成为可能。因此,利用该技术从特定细胞提取高质量RNA成为研究柑橘多胚形成分子机理的关键。本研究利用石蜡切片对‘伏令夏’橙(Citrus sinensis?Valencia‘)果实切片,观察种子中珠心胚起始发生过程,确定珠心胚起始的关键时期;对比不同切片方法、不同多胚材料珠心胚起始细胞形态、数量确定了显微切割配套切片方法及最佳材料;摸索显微切割参数、切割量、RNA提取及检测方法;成功切割收集‘华柑2号’椪柑的珠心胚起始细胞及其周围珠心组织细胞,并提取高质量的RNA,构建了激光显微切割珠心胚起始细胞体系。主要研究结果如下:1、对‘伏令夏’橙各时期的果实进行石蜡切片,观察了珠心胚起始发生全过程。7 DAF胚珠靠近合点端的胚囊外出现核大质浓的珠心胚起始细胞。21 DAF珠心胚起始细胞大量发生,细胞变大,分布相对集中且由合点端向珠孔端靠近。直到35 DAF珠心胚起始细胞开始分裂,并慢慢进入胚囊。之后进入珠心胚的快速发育时期,63DAF进入球形胚时期,胚发育程度表现不同步。最后发育成心形胚、子叶形胚。2、通过观察‘伏令夏’橙、‘华柑2号’椪柑(Citrus reticulata Blanco,PK)、‘鸡尾’葡萄柚(Citrus paradisi Osbeck.?cocktail‘,GF)、红橘(Citrus sunki Hort.)、‘国庆1号’温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)5个柑橘多胚材料10 DAF果实石蜡切片,发现在不染色情况下,‘华柑2号’椪柑每个胚珠中的珠心胚起始细胞数最多,且形态明显区分于周围细胞,是激光显微切割的最佳材料。3、以‘华柑2号’10 DAF果实为材料,卡诺固定液(无水乙醇:乙酸=3:1)固定12 h,后脱水至100%乙醇保存于4℃冰箱。低熔点石蜡paraplast Plus chips(Leica Microsystems)包埋,切片厚度8μm。切片在脱蜡后不经染色便用Leica AS LMD激光显微切割系统切割。在40×物镜下,经过优化的激光参数为:Aperture(孔径)7,power(能量)13,Speed(速度)8,Head Current(发射强度)98%,Pulse Frequency(脉冲频率)1300。收集细胞约10mm2。用RNA提取试剂盒Arcturus PicoPure RNA isolation kit(Life Technologies)抽提总RNA。Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA质量,获得rRNA Ratio[28 S/18 S]:0.5;RNA Integrity Number[RIN]:4.5,可用于构建cDNA文库。