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研究背景:研究表明IAV近年来日益威胁并严重影响人类的健康和社会安全,对禽及人源IAV感染宿主的致病机制研究以及二者致病机制的异同极具研究意义。本课题将禽及人源IAV感染人A549细胞,研究IAV致病能力和固有免疫应答,并对IAV感染后的A549细胞差异表达的miR-3665与IFIT2进行功能的验证和调控机制的探讨,揭示禽及人源IAV的致病机制的异同点,揭示miR-3665与IFIT2在甲型流感病毒感染人A549细胞过程中所发挥的重要调控作用。目的:1.通过禽和人源IAV感染人A549细胞后检测病毒的HA滴度、TCID50、病毒M基因的表达及宿主固有免疫应答相关基因（RIG、NF-κB、IRAK1、IRF3等）的表达结果,阐明禽及人源IAV对人A549细胞的致病特点及激活固有免疫应答能力的异同点。2.通过检测miR-3665的表达与IAV病毒毒力和复制的关系,以及通过敲除/过表达miR-3665后对miR-3665与IFIT2的靶向关系进行验证和敲除/过表达miR-3665后检测RIG-I通路、NF-κB通路相关抗病毒分子基因、蛋白的表达情况,揭示miR-3665及相关通路对禽和人源IAV的毒力和复制能力的差异。3.通过沉默IFIT2基因后检测对禽及人源IAV的毒力、复制能力和细胞免疫应答的影响,探究禽及人源IAV的致病机制的异同点,揭示miR-3665与IFIT2在甲型流感病毒感染人A549细胞过程中所发挥的调控作用。方法:1.我们选用禽源H3N2亚型流感病毒（AVI-9990毒株）和人源H3N2亚型流感病毒（人季节性流感病毒Human-Br07毒株）,模拟人A549细胞的下呼吸道感染模型,检测HA滴度、TCID50、病毒M基因的表达;2.检测宿主固有免疫应答相关基因的表达,包括RIG、NF-κB、IRAK1、IRF3、TRAF6、CXCL2、CXCL10、CCL5、TNF、IL-6、IL-8、IFN-α和IFN-β及ISGs家族相关基因IFIT2、Mx1、Mx2;3.建立病毒感染细胞模型,检测4 h、8 h、24 h和48 h时病毒HA滴度、TCID50和miR-3665的表达;4.分别使用miR-3665的抑制剂（inhibitor）和模拟物（mimic）转染A549细胞,检测去表达或过表达miR-3665后miR-3665的表达量情况,还有IFIT2基因和蛋白的变化情况和表达量的差异,用双荧光素酶实验验证miR-3665与IFIT2是否存在靶向关系;5.去表达/过表达miR-3665后,检测RIG-I通路、NF-κB通路的抗病毒分子基因RIG、NF-κB、IRAK1、IRF3、TRAF6、CXCL2、CXCL10、CCL5、TNF、IL-6、IL-8、IFN-α和IFN-β及ISGs家族相关基因IFIT2、Mx1、Mx2的表达;6.构建模拟细胞miR-3665的去表达或过表达模型,分别感染AVI-9990和Human-Br07病毒株,24 h后检测流感病毒HA、TCID50、M基因表达量,及相关固有免疫基因IL-6、IL-8、IFN-α和IFN-β;7.将IFIT2的沉默序列转染A549细胞,转染24 h后,分别用AVI-9990和Human-Br07病毒感染已转染si-IFIT2的细胞,感染24 h后,再次检测流感病毒HA、TCID50、M基因表达量。结果:1.Human-Br07的HA滴度结果、TCID50和病毒M基因的表达都低于AVI-9990。一方面表明AVI-9990的毒力和复制能力均强于Human-Br07;另一方面表明AVI-9990对人A549细胞的适应能力较强,而Human-Br07对人A549细胞的适应能力较弱;2.固有免疫抗病毒RIG-I通路、NF-κB通路中,参与的相关抗病毒因子RIG、NF-κB、IRAK1、IRF3、TRAF6、CXCL2、CXCL10、CCL5、TNF、IL-6、IL-8、IFN-α和IFN-β及ISGs家族相关基因IFIT2、Mx1、Mx2的表达均高于Control组,说明Human-Br07和AVI-9990均能激活宿主固有免疫应答机制抗病毒感染。此外,Human-Br07组上述基因的表达均高于AVI-9990组的基因表达量。3.miR-3665 mimic转染人A549细胞后,用双荧光素酶实验证实miR-3665与IFIT2的靶向关系。双萤光素酶相对活性结果显示miR-3665与对应的基因IFIT2靶点有作用。4.miR-3665 mimic转染人A549细胞后,检测RIG-I和NF-κB通路中相关基因的表达,结果显示:和miR-3665 Mimic-NC相比,miR-3665的上调也会造成RIG-I、NF-κB、IRAK1、TRAF6、IFN-α、IFN-β和Mx2的表达均下调,而IRF3、Mx1、CXCL10和TNF的表达上调;5.miR-3665 mimic转染人A549细胞后再分别感染Human-Br07和AVI-9990,结果表明:转染miR-3665 mimic增强Human-Br07和AVI-9990的复制能力和毒力,减弱固有免疫应答反应;6.si-IFIT2转染人A549细胞后再分别感染Human-Br07和AVI-9990,结果表明:转染si-IFIT2会增强Human-Br07和AVI-9990的复制能力和毒力,也会减弱细胞免疫应答反应。结论:本研究以禽源H3N2亚型流感病毒（AVI-9990）和人源H3N2亚型流感病毒（Human-Br07）IAV作为研究对象,围绕两种病毒的致病机制和与病毒感染相关miR-3665与IFIT2的相互作用机制开展研究。初步得到以下结论:1.我们研究发现AVI-9990体外感染人A549细胞的毒力和复制能力及对该细胞的适应能力均强于Human-Br07。而Human-Br07和AVI-9990病毒的感染均能激活宿主固有免疫应答机制抗病毒感染。对于RIG-I通路、NF-κB通路相关抗病毒基因（RIG、NF-κB、IRAK1等）而言,Human-Br07组的表达均高于AVI-9990组的基因表达量。进一步说明AVI-9990病毒对人A549细胞有更强的致病能力,导致人A549细胞对该病毒的固有免疫应答能力较弱。2.本研究还证实miR-3665与IFIT2存在靶向关系。miR-3665会能激活RIG-I通路、NF-κB通路,引起IFIT2等基因的分泌,影响病毒的复制、毒力情况和以及影响人A549细胞的固有免疫应答反应。并且,miR-3665的上调和IFIT2的沉默,能增强病毒的复制和毒力,降低固有免疫应答反应。综上所述,miR-3665在不同种属IAV感染过程中发挥着重要的调控作用,miR-3665在RIG-I信号通路的介导下调控IFIT2增强不同种属IAV的生命活动,这些结论提示可利用miR-3665进行抗流感靶点研究的潜在价值。