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本试验通过建立奶牛乳腺上皮细胞(bovinemammaryepithelialcells，BMEC)分离培养体系，研究奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性;构建乳铁素H真核表达载体，提高转基因的效率;利用电穿孑乙转基因方法将乳铁素H（LactoferricinHuman，Lfcin-H）基因转入奶牛乳腺上皮细胞，获得转基因克隆牛供体细胞，对转染的细胞进行分子生物学检测，为奶牛乳腺生物反应器的研究奠定基础，试验取得以下结果:
1、通过贴壁筛选法分离培养奶牛乳腺上皮细胞，观察其生长特性，经传代纯化，绘制P5代细胞生长曲线，细胞可以稳定传代至15代保持未分化状态且染色体核型正常。
2、采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织扩增同源重组引导序列左右臂HRDS1和HRDS2片段，将其克隆到真核表达载体pEGFP-N3-tPA上，构建乳铁素H真核表达载体pCAM，对重组质粒进行测序鉴定。
3、分别采用500、700、900和1100V/cm和1、5、10、和15ms的参数组合，将线性化的带有新霉素抗性、卡那霉素抗性和绿色荧光蛋白三重筛选标记的乳铁素H乳腺特异表达载体pCAM电穿孔转入体外培养的P5代奶牛乳腺上皮细胞，经800μg/mL(G418筛选1周，300μg/mLG418和10μg/mLGCV筛选1周后扩大培养2～3代，在场强700V/cm，脉冲时程5ms，DNA4μg，细胞密度106～107个/mL条件下，转染处于对数生长期的P5代细胞效果最佳，取部分筛选后的细胞进行PCR检测得到预期条带。
本研究结果显示:获得了高纯度且增殖能力较强的奶牛乳腺上皮细胞，体外传代15次后核型未发生改变;PCR克隆出奶牛乳腺组织HRDS1和HRDS2片段，重组阳性克隆测序鉴定证实目的片段已正确插入pEGFP-N3-tPA载体，构建了乳铁素H真核表达载体pCAM;转染后24～48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达，筛选后各组克隆形成数以700V/cm和5ms组最多，PCR检测得到了预期条带。