目的通过建立新生小鼠脑切片体外循环灌流模型,探讨本模型能否复制体外循环(CPB)和深低温停循环(DHCA)脑损伤病理生理状态,并研究脑切片灌流及氧糖剥夺(OGD)是否造成白质中少突胶质前细胞(pre OL)损伤及小胶质细胞(MG)活化,干预相关机制是否能减轻白质损伤,为体外循环白质损伤及保护提供细胞学证据。方法(1)实验模型建立:选择出生7日(P7,相当于人类35-36孕周)SD大鼠,制成脑片,建立离体脑切片灌流系统,利用人工脑脊液(a CSF)及氧糖剥夺溶液(OGD)灌流,模拟心脏手术CPB/DHCA整个过程;(2)实验脑切片根据灌注方式(a CSF、OGD),温度(36℃、32℃、25℃、15℃),应用米诺环素及逐级再氧合方法进行分组;(3)免疫组化(MBP,O4,Iba-1抗体),Western blot(Iba-1)及ELISA(IL-6,TNFα)检测。结果(1)在OGD实验组中,成熟少突胶质(MBP阳性)细胞及pre OL(O4阳性)细胞存在明显损伤,而且OGD温度越高损伤也越严重,O4阳性表达在对照组与15℃ OGD组之间则无显著性差异;(2)实施OGD后MG(Iba-1阳性)活化程度升高,TNFα及IL-6浓度上升。在36℃ OGD应用米诺环素后可降低MG活化程度,减小TNFα及IL-6浓度,并减轻pre OL损失,在低温(15℃,25℃)OGD共同应用米诺环素后对MG活化无明显抑制作用;(3)采用逐级增氧技术后MG活化程度降低,TNFα及IL-6浓度减小,并减轻pre OL损失。结论本研究模型能有效模拟CPB/DHCA脑损伤病理生理状态,并证明MG活化是CPB和DHCA导致白质损伤的重要机制,可导致pre OL的损伤,分化为下游的少突胶质细胞数量减少,最终导致轴突低髓鞘化和白质损伤。同时亦发现逐级再氧合方法可通过抑制MG活化,降低IL-6及TNFα浓度,最终减轻pre OL损伤而保护白质,为临床白质保护技术提供新思路。第一部份:体外循环的脑白质损伤研究目的脑白质(WM)损伤是新生儿和婴幼儿先天性心脏病(CHD)手术后严重的神经并发症。目前推测手术中体外循环(CPB)和深低温停循环(DHCA)是WM损伤发生的重要因素,但尚未从细胞和组织学水平上证实。本研究拟建立新生小鼠离体脑切片灌流及氧糖剥夺(OGD)模型,模拟新生儿心脏手术中CPB和DHCA病理生理过程,旨在探讨:(1)脑切片实验模型能否复制CPB和DHCA脑损伤效果;(2)脑切片灌流及OGD是否造成WM中少突胶质前体细胞(pre OL)的损伤。方法(1)实验模型建立:选择出生7日(P7,相当于人类35-36孕周)SD大鼠,制成脑片,建立离体脑切片灌流系统,利用人工脑脊液(a CSF)及缺糖缺氧溶液(OGD)灌流,模拟心脏手术CPB/DHCA整个过程;(2)实验分组:根据灌注方式和温度不同分为5组,全程灌流(36℃)对照组及60分钟OGD实验组:36℃,32℃,25℃和15℃;(3)免疫组化检测:MBP及O4抗体。结果(1)在OGD实验组中,成熟少突胶质(MBP阳性)细胞存在明显损伤,其形态学明显变化和荧光表达明显减少,而且OGD温度越高损伤也越严重;(2)在OGD实验组中,pre OL(O4阳性)细胞在36℃,32℃及25℃组均出现不同程度的荧光表达减少,而且OGD温度越高荧光表达减少越明显,O4阳性细胞的形态学和荧光表达改变在对照组及15℃ OGD组之间无显著性差异。结论根据实验结果表明,本模型能有效模拟CPB/DHCA脑损伤规律;而且这种损伤可导致少突胶质细胞系发育关键阶段的pre OL的损伤,分化为下游的少突胶质细胞(OL)数量减少,最终导致轴突低髓鞘化和WM损伤。第二部份:体外循环脑白质损伤的细胞学机制研究目的WM损伤与小胶质细胞(MG)活化有关,MG活化后会通过一系列机制损伤少突胶质细胞(OL),引起脑白质髓鞘化和损伤,导致脑室周围白质软化症(PVL)发生,但是心脏手术中CPB及DHCA是否可引起MG活化未被证实。本研究通过离体脑切片灌流模型模拟CHD患者心脏手术中CPB/DHCA,探讨:(1)CPB/DHCA是否存在MG活化现象,以及MG活化与WM损伤的关系;(2)应用MG活化抑制剂米诺环素是否可以抑制MG活化及减轻相应的WM损伤。方法(1)实验模型建立:选择出生7日(P7,相当于人类35-36孕周)SD大鼠,制成脑片,建立离体脑切片灌流系统,利用人工脑脊液(a CSF)及缺糖缺氧溶液(OGD)灌流,模拟心脏手术CPB/DHCA整个过程;(2)实验分组:根据不同温度及灌流液分为7组,包括:(1)36℃氧合Pa CSF对照组;(2)60分钟OGD组:36℃,25℃和15℃;(3)60分钟OGD+米诺环素组:36℃,25℃和15℃并各自加入10μM米诺环素。在60分钟OGD+米诺环素组中,脑片在灌流前预先孵育10μM的米诺环素1小时,并且之后加入10μM的米诺环素到灌流液中进行灌流;(3)检测:(1)免疫组化检测:O4及Iba-1抗体;(2)Iba-1 Western blot蛋白分析;(3)IL-6及TNF的ELISA检测分析。结果(1)在OGD实验组中,发现不同温度组中均存在MG活化,而且显示MG活化的Iba-1蛋白浓度随着OGD时的温度上升而表达增高;同时发现O4阳性的pre OL细胞数量随着OGD时的温度上升而数量显著减少,TNFα和IL-6浓度随着OGD时的温度上升而升高;(2)在OGD+米诺环素组中,发现米诺环素可有效抑制MG活化,而且随着OGD温度上升,米诺环素抑制MG活化的作用更加显现;同温度OGD组间比较发现,在36℃组中,O4阳性的pre OL细胞数量显著减少,TNFα和IL-6浓度显著降低,在25℃及15℃组中,与OGD组25℃及15℃比较,O4阳性的pre OL细胞数量减少无统计学差异,TNFα和IL-6浓度变化无显著差异。结论CPB和DHCA可引起MG活化,导致pre OL损伤;抑制MG活化可减轻相应pre OL损伤,这表明MG活化是CPB和DHCA导致WM损伤的重要机制,但是在中度低温和深低温条件下,米诺环素抑制MG活化的作用有限。第三部份:逐级再氧合方法对脑白质的保护作用研究目的在心脏手术中,DHCA缺血后恢复体外循环时可导致全身再灌注损伤,在组织缺氧后接受高浓度氧再氧合时可造成起缺氧组织的再氧合损伤,在再灌注和再氧合阶段通过控制性再灌注和再氧合方法是减轻再灌注和再氧合损伤的重要途径。本研究通过离体脑切片灌流及OGD模型模拟CHD患者心脏手术中CPB/DHCA过程,在OGD后再氧合阶段采用逐级再氧合方法,观察是否能够减轻WM损伤,为临床WM损伤的保护提供一种可行有效的方法。方法(1)实验模型建立:选择出生7日(P7,相当于人类35-36孕周)SD大鼠,制成脑片,建立离体脑切片灌流系统,利用人工脑脊液(a CSF)及缺糖缺氧溶液(OGD)灌流,模拟心脏手术CPB/DHCA整个过程;(2)实验分组:离体脑切片分为3组:(1)36℃氧合Pa CSF对照组;(2)36℃ 60分钟OGD组,OGD结束后再灌注液采用100%氧气氧合循环,PO2约500-600mm Hg;(3)36℃ 60分钟OGD+逐级再氧合组,OGD结束后更换再灌注液采用逐级增氧的再氧合方法:OGD刚结束氧浓度21%,10分钟后调节至40%,30分钟后调节至60%,之后以60%氧浓度持续维持;(3)检测:免疫组化(O4,Iba-1抗体),Western blot(Iba-1)及ELISA(IL-6,TNFα)检测。结果同36℃ OGD组比较发现,逐级再氧合组pre OL细胞数量有显着减少,MG活化程度为减轻,同时Il-6及TNFα也有显着减少。结论逐级再氧合方法可通过抑制MG活化,降低IL-6及TNFα浓度,最终减轻pre OL损伤而保护WM。为临床WM保护技术提供新思路。