一、背景周围神经损伤的治疗一直是显微外科的难题,其中一些粗大、长段的周围神经缺损和多发性神经损伤,其再生很难重建其正常结构,也很难再建立和远端的正常联接。自体神经移植在临床上依旧是“金标准”,但有神经来源有限、牺牲次要神经功能、产生供区神经瘤等缺点,且供体神经常常无法满足修复粗大神经缺损的需要。因而临床上迫切需要更安全有效的治疗策略。人工合成可降解材料如聚乙醇酸导管NeurotubeTM聚乳酸-聚己内酯共聚物导管Neurolac、I型胶原导管NeuraGen等已被广泛用于实验及临床修复感觉或运动神经缺损,然而,由于缺乏良好微环境及充足的生物活性物质,单一的神经导管很难修复长节段、粗大周围神经缺损。理想的神经修复材料应具有良好的细胞亲和性和组织相容性,可在体内降解吸收且降解产物无毒副作用,降解速度与神经轴突再生相同步,并可为轴突生长提供所需的生物活性物质。大量研究表明,细胞粘附因子和神经营养因子在损伤神经再生和功能恢复过程中发挥着至关重要的作用。通过引入外源性神经营养因子和种子细胞,构建出复合型神经导管以促进受损神经的结构和功能修复,成为目前神经组织工程领域的研究热点。二、目的1)体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,利用神经营养因子对其进行定向诱导分化为神经样细胞(BMSC-NCs),并以其为种子细胞,与自行研制的RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子(PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF, PNGF)支架材料复合构建周围神经组织工程模型,通过动物实验评估其用于修复大鼠坐骨神经缺损的疗效。2)通过临床应用课题组研制的RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙(PRGD/PDLLA/β-TCP, PRGD)复合型神经导管,验证该材料治疗周围神经损伤的疗效和安全性,并与同类产品临床性能相比较,探索周围神经损伤后应用该材料在促进神经再生方面所起的作用及其安全性和适应症。三、方法1、利用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,并用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导其定向分化为神经样细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组化鉴定神经元特异标志物神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白和突触囊泡膜特异性蛋白质突触素蛋白的表达。2、SPF级雄性Wistar大鼠40只,随机分为4组,每组10只,左侧后肢建立12mm坐骨神经缺损模型。三组为PNGF导管移植复合PBS (A), BMSCs(B), BMSC-NCs(C)；第四组为自体神经移植组(D)。所有大鼠左侧为实验侧,右侧为正常自身对照侧。术后分笼喂养,观察切口愈合情况及步态。3、术后3个月,将体内神经导管材料取出,观察其大体形态、表面血管化及组织生长情况；制作大鼠足印行走箱,测定坐骨神经功能指数；麻醉下对双侧肢体行神经电生理检查,记录潜伏期、波幅并计算神经传导速度；处死动物,取双侧小腿三头肌,分析天平称重后计算患侧小腿三头肌湿重恢复率；小腿三头肌石蜡包埋后行HE染色进行组织学观察；取双侧坐骨神经,分别行石蜡包埋后行HE染色和树脂包埋后行亚甲蓝染色,光镜下对再生神经进行组织形态学观察。4、在大量动物实验基础上,制定了产品注册标准,并通过了国家医疗器械天津检测中心的检测后,应用可吸收诱导神经修复材料修复人类粗大周围神经缺损,术后综合感觉、运动功能检查,电生理检查及高频B超检查评价神经功能恢复情况。四、结果1、成功从大鼠骨髓中分离出骨髓间充质干细胞,培养10天后细胞呈成纤维细胞样的长梭形,胞核卵圆形,胞浆丰富,彼此融合成片。应用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子可在体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经样细胞,免疫组化结果表明细胞表达神经元特异标记蛋白神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白及突触囊泡膜特异性蛋白质突触素蛋白,证明该细胞不仅形态学发生改变,而且分子水平也随之发生改变。2、动物实验结果2.1术后大体观察：手术切口均一期愈合,皮肤未见红肿,无异物反应。至实验完成,所有动物存活。术后2周起,各组大鼠患侧肢体出现拖地行走、跛行、足部皮肤红肿及足跟溃疡等神经营养障碍表现,随时间延长逐渐恢复。术后患侧小腿三头肌逐渐萎缩,D组萎缩程度较其他3组轻。2.2坐骨神经功能指数：A、B、C、D组坐骨神经功能指数分别为-75.15+4.54、-66.99±4.76、-65.75±5.20、-63.33+3.82,B、C、D组高于A组,差异有统计学意义(p<0.001),B、C、D组之间比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.3电生理检测：术后3个月刺激神经干,记录能引起各组动作电位的刺激电极与接受电极距离、潜伏期并计算出传导速度。术后3个月各组大鼠患侧均可引出复合肌肉动作电位,B组神经传导速度恢复率高于A组,差异有统计学意义(p<0.05)；C、D组均高于A组,差异有统计学意义(p<0.001)；B组与A组比较,差异有统计学意义(p<0.05)；C组和D组比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.4小腿三头肌湿重恢复率：各组大鼠患侧肌肉不同程度萎缩, B、C、D组小腿三头肌恢复率均明显高于A组,差异有统计学意义(p<0.001)；D组高于B组,差异有统计学意义(p<0.05)；B、D组和C组比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.5组织形态学观察2.5.1小腿三头肌HE染色：正常小腿三头肌肌纤维为多边形,大小、形态均一、规则,细胞核紧靠肌膜；D组肌纤维形态规则,与正常肌肉相似；C组肌纤维直径较D组小,肌纤维排列较密集,肌束间可见少量疏松结缔组织；B组大部分肌纤维呈圆形或椭圆形,肌束间可见较多纤维组织；A组肌纤维形态多样,大小不一,可见少许细小肌纤维散在分布,细胞核多,染色反应强,肌束间有大量疏松结缔组织。B、C、D组肌细胞横截面积恢复率均高于A组,差异有统计学意义(p<0.001)；D组高于B组,差异有统计学意义(p<0.01)；B、D组和C组比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.5.2再生神经大体观察：取材时见导管与周围组织无明显粘连,管壁变薄,管内有连续性再生神经通过,表面可见营养血管爬行生长,直径较正常神经细。导管植入部位无明显渗液、脓肿等不良反应。2.5.3再生神经HE染色示C、D组神经纤维致密,连续性好,排列整齐,髓鞘清晰,可见无髓鞘包裹的郎飞氏结(Ranvier、snode):A.B组神经纤维比C、D组稀疏,排列较整齐。亚甲蓝染色：D组神经外膜完整,有髓神经纤维数量多,大小均匀,排列紧密,髓鞘厚,成熟良好,并开始出现分束；C组见再生有髓纤维,形态与D组相似；B组再生的神经纤维较稀疏、髓鞘较薄,排列较整齐；A组再生纤维细小,髓鞘薄,数量少,分布松散,血管和纤维结缔组织多,神经排列紊乱。A组有髓神经纤维数量、直径及髓鞘厚度与B、C、D组比较差异有统计学意义(p<0.001),B、C、D组之间比较差异无统计学意义(p>0.05)。D组有髓神经纤维直径及髓鞘厚度高于B组,差异有统计学意义(p<0.01)。B、D组和C组比较差异无统计学意义(p>0.05)。3、临床试验结果15例患者术后随访6月～23月,平均13.1月。所有患者伤口均一期愈合,无感染、渗出等不良反应。其中11例患者术后感觉与运动功能不同程度恢复,改善率达73.3%,等同于同类产品的临床性能；根据中华医学会手外科学会上肢周围神经功能评定试用标准进行评分,优5例,良4例,可2例,无明显改善4例。术后肌电图检查确定11例患者神经传导功能有恢复；高频超声显示植入导管在位,未见与周围组织明显粘连。五、结论1、联合利用碱性成纤维生长因子和表皮生长因子可在体外诱导大鼠骨髓间充质于细胞定向分化为神经样细胞,但这些细胞是否具备成熟神经元的传导功能尚需进一步研究。2、PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合BMSC-NCs能成功修复大鼠12mm坐骨神经缺损,修复效果与自体神经移植相近。3、PRGD/PDLLA/β-TCP复合型神经导管应用于临床修复周围神经缺损,疗效等同于同类产品的临床性能,能有效促进周围神经再生,未见不良反应,可作为周围神经损伤较理想的替代疗法。