第一部分补肝益肾中药对人黑素细胞黑素合成及迁移的影响目的对文献报道的白癜风中医治疗肝肾不足证中高频使用的3味中药(制何首乌、墨早莲、熟地黄)进行体外实验,检测其水提物对人黑素细胞活力、酪氨酸酶活性、黑素合成及细胞迁移的影响,对3味中药治疗白癜风的机理进行了初步探讨。方法(1)采用健康青年包皮环切术后的包皮组织进行体外细胞原代培养,获得人表皮黑素细胞。(2)采用MTT法检测3味中药不同浓度的水提物对黑素细胞活性的影响,多巴氧化法检测对细胞酪氨酸酶活性的影响及氢氧化钠裂解法检测对黑素含量的影响。同时采用Transwell小室法检测3种中药水提物对黑素细胞迁移的影响及western blot法测定对MITF蛋白表达的影响。结果(1)25、50、100、200ug/mL制何首乌对人黑素细胞活力的影响与空白对照组相比均无统计学差异(P>0.05),400ug/mL组可促进黑素细胞增殖(P<0.05)；25、50、100、200、400ug/mL墨旱莲组均对人黑素细胞活力的无影响(P>0.05)；25、50、100、200ug/mL熟地黄组对人黑素细胞活力无影响(P>0.05),400ug/mL组可促进黑素细胞增殖(P<0.05)。(2)各浓度制何首乌组及熟地黄组对人黑素细胞酪氨酸酶活性的影响虽呈上升趋势,但无统计学差异(P>0.05)；50、100、200、400ug/mL墨旱莲组可显著提高黑素细胞酪氨酸酶活性(P<0.05)。(3)各浓度制何首乌组对人黑素细胞黑素含量的影响虽呈上升趋势,但与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)；50、100、200、400ug/mL墨早莲组及熟地黄组可显著提高黑素细胞的黑素含量(P<0.05)。(4)100ug/mL制何首乌组及墨旱莲组穿过聚碳酯膜的黑素细胞数目分别为对照组的263%、172%,差异有显著性(P<0.05)；熟地黄组穿过的细胞数目较少,与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。(5)100ug/mL制何首乌组、墨旱莲组、熟地黄组MITF蛋白的表达量分别为对照组的140%、145%、143%,差异具有显著性(P<0.05)。结论(1)制何首乌水提物可促进黑素细胞增殖、迁移及MITF的表达,但是对酪氨酸酶活性及黑素合成无影响；熟地黄水提物可促进黑素细胞增殖、黑素合成及MITF的表达,但对酪氨酸酶活性、细胞迁移无影响。(2)墨旱莲水提物对黑素细胞生长无影响,但可以促进酪氨酸酶活性、黑素合成、细胞迁移及MITF的表达,提示其机理可能是通过促进黑素细胞移行及黑素合成2个环节发挥治疗作用,值得进一步研究。第二部分H202所致人黑素细胞线粒体功能障碍对细胞迁移的影响及墨旱莲的干预作用目的 建立正常人黑素细胞氧化损伤模型；通过检测H202所致氧化应激状态对人黑素细胞迁移、细胞骨架、线粒体超微结构、线粒体膜电位、ATP含量的影响及墨早莲的干预作用,探讨H202所致线粒体功能障碍对人黑素细胞迁移的影响及墨旱莲的保护作用。方法(1)采用MTT法检测不同浓度、不同时间点H202对黑素细胞活性的影响。(2)设立正常对照组、H202处理组、(50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL)墨旱莲+H202处理组,采用Transwell小室法观察不同处理因素对黑素细胞迁移的影响；罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色后共聚焦显微镜下观察不同处理因素对细胞骨架F-actin的影响；透射电镜下观察不同处理因素对细胞线粒体超微结构的影响；荧光探针JC-1检测各处理因素对人黑素细胞膜电位的影响；荧光素酶法检测各处理因素对人黑素细胞内ATP含量的影响。结果(1)建立了H202诱导体外黑素细胞氧化应激的模型。(2)与空白对照组比较,HRO2处理组能明显抑制黑素细胞的迁移(P<0.05)；与H2O2处理组比较,50ug/mL、100ug/mL、 200ug/mL墨旱莲预处理各组细胞迁移率均有明显提高(P<0.05)。(3)与空白对照组比较,H202处理组细胞质内纤维型肌动蛋白变得模糊不清、消失,且树突明显缩短。不同浓度墨旱莲预处理后各组黑素细胞质内纤维型肌动蛋白排列紊乱,但仍然可见,200ug/mL组细胞树突明显增多。(4)电镜下H202处理组细胞内线粒体基质电子密度降低,嵴模糊不清甚至消失,可见空泡形成；不同浓度墨早莲预处理后各组黑素细胞线粒体轻度肿胀,线粒体内的嵴扩张,但仍可见到部分结构清晰的线粒体。(5)与空白对照组比较,H202处理组能明显降低黑素细胞线粒体膜电位(P<0.05)；与H202处理组比较,不同浓度墨旱莲预处理后各组细胞线粒体膜电位均有明显提高(P<0.05)。(6)与空白对照组比较,H202处理组能明显降低黑素细胞内ATP的含量(P<0.05)；与H202处理组比较,不同浓度墨旱莲预处理后各组细胞内ATP含量均有明显提高(P<0.05)。结论(1)0.1mM H2O2处理30min的条件下可诱导人黑素细胞产生氧化应激损伤。(2)H202所致的氧化应激状态可能是通过影响黑素细胞线粒体功能,降低了ATP生成,破坏了细胞骨架,从而抑制了细胞的迁移。(3)墨旱莲提取物则可能是通过保护了线粒体功能而达到改善H202造成黑素细胞迁移障碍的作用。第三部分 墨旱莲对H202所致人黑素细胞线粒体功能氧化损伤相关信号分子的影响目的探讨H202所致人黑素细胞线粒体功能氧化损伤的相关分子机制及墨旱莲的保护作用。方法(1)采用原代培养三个不同人来源的黑素细胞,分别设立正常对照组、H202处理组,通过6张表达谱芯片筛选H202作用下差异表达的与线粒体功能障碍相关信号分子,并采用实时荧光定量RT-PCR验证差异表达的基因。(2)设立正常对照组、H202处理组、(50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL)墨旱莲+H202处理组,采用实时荧光定量RT-PCR及western blot法从mRNA和蛋白水平对筛选出的基因进行检测。结果(1)以Fold change≥2为标准筛选差异表达的mRNA分子,结果显示共有1880个差异表达基因,其中763个基因表达上调、1117个基因表达下调。进一步通过GO分析和Pathway分析,从中挑选出与线粒体氧化磷酸化有关的差异表达基因11个,经验证显示和未予H202处理的对照组相比,H202处理组ND2、COX1和COX3基因的表达下调(P<0.05)。(2)不同浓度墨旱莲提取物预处理组与H202组比较,均能明显上调基因ND2、 COX1及COX3的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。结论(1)表达谱芯片筛选并验证后提示H202明显抑制线粒体氧化磷酸化过程中ND2、 COX1及COX3基因的表达,提示H202所致的氧化应激状态可能通过抑制上述基因的表达,干扰线粒体呼吸链,影响氧化磷酸化过程,抑制ATP合成,进而引起黑素细胞迁移障碍。(2)墨旱莲水提物预处理黑素细胞后通过上调基因ND2、COX1及COX3的表达,部分恢复线粒体氧化磷酸化过程,提高了ATP含量,而达到改善H202所造成的黑素细胞迁移障碍的作用。