研究背景:2007年,美国4000多只狗、猫食用了含有三聚氰胺的饲料而出现肾功能衰竭。2008年,因长期食用含有三聚氰胺的婴幼儿配方奶粉,我国累计294,000婴幼儿接受检查治疗,其中住院患儿51,900人,死亡4人,主要是因为三聚氰胺导致了泌尿系结石和肾衰竭。2008年,就诊于我院门诊的泌尿系结石患儿数量也明显增多,这些患儿年龄多在3岁以内,表现为发热、咳嗽、咳痰、哭闹、恶心、腹泻、呕吐、少尿、无尿、血尿等症状,少数家属发现患儿尿液混浊或在患儿尿液中发现泥沙样结石排出,通过超声可以诊断为泌尿系结石。当询问这些患儿病史时,我们发现这些患儿都在喂养同一品牌奶粉(三鹿牌婴幼儿配方奶粉)。随后,我院泌尿外科将该事件及时上报省卫生厅。并针对这一社会重大热点问题,采用流行病学方法探讨了婴幼儿发生三聚氰胺泌尿系结石以及梗阻性急性肾损伤的危险因素。在临床诊治过程中探索了体外冲击波碎石、手术干预等治疗方案,改进了药物溶石及肾后性急性肾损伤的治疗方案,建立了一整套行之有效的诊疗方法。对部分患儿进行了1到3年的跟踪随访,并对不同治疗方式的安全性、有效性进行了评价。采用相关物理化学方法,定量测定了患儿结石、血浆及尿液标本中三聚氰胺含量并定性分析了结石的形态及成分。然而关于三聚氰胺相关泌尿系结石细胞和动物模型的建立及实验研究在国内外均较少,氧化损伤被认为是普通泌尿系结石形成的重要机制之一,本研究首先建立三聚氰胺相关泌尿系结石细胞和动物模型,之后我们利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶的抑制剂香荚兰乙酮(apocynin)对这两种模型进行干预,为抗氧化损伤预防和治疗三聚氰胺相关泌尿系结石提供分子生物学依据。研究目的:通过建立三聚氰胺相关泌尿系结石细胞和动物模型,观察氧化损伤程度、泌尿系结石相关蛋白的表达、动物肾脏组织病理变化、肾脏内结晶的沉积和肾毒性的改变,并预防性和治疗性的使用apocynin,观察上述指标的变化。从而探讨三聚氰胺相关泌尿系结石发病机制,为泌尿系结石的发病机制提供相应的理论依据。实验方法:在细胞实验中,通过三聚氰胺和三聚氰酸(melamineandcyanuricacid,mca)的混合物(600μmol/l,1:1)刺激人肾皮质近曲小管上皮细胞(hk-2)来建立三聚氰胺相关泌尿系结石的细胞模型。同时预防性或治疗性地给予不同浓度的香荚兰乙酮(apocynin)(0.1或0.2mmol/l),当mca混合物作用hk-2细胞24小时后,收集细胞和培养液,检测氧化应激(os)的指标丙二醛(mda)、8-异前列腺素(8-ip)及超氧化物歧化酶(sod)。同时用免疫印迹(westernblotting)的方法半定量检测泌尿系结石相关蛋白骨桥蛋白(opn)和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)的表达情况。在动物实验中,通过给予mca混合物(400mg/day/kg,1:1)诱导雄性sd大鼠三聚氰胺相关泌尿系结石的形成。同时预防性或治疗性地给予不同浓度的香荚兰乙酮(0.2或0.4g/kg/day),造模28天后,对大鼠和其肾脏进行称重,并收集大鼠的尿液、血液和肾脏,检测os和肾毒性(绝对肾重量、相对肾重量、尿素氮和血肌酐)的指标,对大鼠一侧肾脏用20%的甲醛进行固定并进行he染色石蜡切片,普通光学显微镜下观察大鼠肾脏的病理变化及结晶的形成情况并进行评分。并用激光共聚焦显微镜对没有he染色透明的石蜡切片内的结晶进行观察。同时用免疫组织化学的方法对肾组织切片进行免疫组化染色,观察泌尿系结石相关蛋白opn和p-p38mapk的表达情况,用westernblotting的方法对这两种蛋白进行半定量。实验结果:在细胞实验中,被mca混合物诱导的hk-2细胞中,os指标、opn和p-p38mapk两种泌尿系结石相关蛋白表达都是增高的,当预防性的给予apocynin后,上述指标下降(p<0.05).但是当治疗性的给予apocynin后,os指标下降(p<0.05),但结石相关蛋白opn和p-p38没有显著的变化(p>0.05)。在动物实验中,mca混合物诱导的三聚氰胺相关泌尿系结石sd大鼠肾毒性、肾脏病理变化评分、肾结晶评分、os指标以及泌尿系结石相关蛋白都较正常大鼠显著增高(p<0.05),当预防性的给予apocynin后,上述指下降(p<0.05)。当治疗性的给予apocynin后,os指标下降(p<0.05),但上述其他指标较三聚氰胺相关泌尿系结石大鼠无显著改善(p>0.05)。实验结论:OS是三聚氰胺相关泌尿系结石发病的重要机制之一,apocynin对三聚氰胺相关泌尿系结石具有一定的预防性作用。