论文部分内容阅读
口服疫苗通过胃肠粘膜进行抗原递送,经消化道内的免疫应答通路产生与常规注射类似的免疫反应。但由于具有免疫原性的物质如蛋白,核酸类药物不稳定,进入消化道后易受消化道内恶劣的酶和pH环境的影响导致大量被降解;其次,这些大分子药物难以突破消化道上皮细胞屏障进入粘膜下层与免疫应答通路产生相互作用,因而胃肠粘膜对抗原产生免疫的能力弱,口服免疫所需的抗原量很大,使口服免疫的应用受到了限制。随着医学和分子生物学技术的发展,人们发现采用聚合物纳米载体可有效保护大分子药物不被降解,延长在消化道内粘膜的滞留时间,同时克服胃肠道上皮细胞屏障,提高抗原与免疫通路的相互作用,有效地诱导机体产生免疫应答而备受关注。本课题以具有免疫原性的大分子——卵清蛋白(OVA)为模型药物,设计构建了一种基于穿膜肽TAT的聚合物药物载体,即TAT修饰的聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸纳米粒(TAT PLGA-γ-PGA NPs)。该疫苗递送系统利用TAT的高效穿膜作用克服消化道粘膜上皮细胞屏障,诱导机体产生免疫反应,为口服疫苗递送系统的设计提供有价值的参考。本研究第一章对聚合物纳米粒进行制备和表征。首先将聚丙交酯乙交酯(PLGA-COOH)与γ-聚谷氨酸(γ-PGA)通过伸乙二氧基二乙胺基(Eb E)共价连接合成聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸(PLGA-γ-PGA)共聚物。经1H核磁图谱表征,共聚物PLGA-γ-PGA已成功合成了。再将共聚物PLGA-γ-PGA与穿膜肽TAT共价连接形成TAT修饰的PLGA-γ-PGA。采用W/O/W复乳化-溶剂挥发法制备包载OVA的PLGA-γ-PGA NPs与TAT PLGA-γ-PGA NPs,粒径分别为(282.5±11.6)nm,(263.8±7.4)nm,粒径分布较为均一;Zeta电位分别为(-27.9±2.6)m V,(20.0±1.8)m V;载药量分别为(6.43±0.26)%,(4.54±0.83)%;包封率分别为(68.7±3.0)%,(47.7±9.1)%。扫描电镜下观察到两种聚合物纳米载体形态均为球形,分布均一,具有空洞结构。体外药物释放结果显示,聚合物纳米粒明显减缓了OVA释放速度,并且TAT PLGA-γ-PGA NPs的释药行为比PLGA-γ-PGA NPs更为缓慢。本研究第二章以Caco-2细胞为细胞模型,通过香豆素6(C6)荧光探针对聚合物纳米粒的细胞摄取及转运机制进行了研究。细胞摄取结果显示,TAT PLGA-γ-PGA NPs在胞内的荧光强度明显高于PLGA-γ-PGA NPs,且随着TAT修饰量的增加而增加。表明TAT能够显著提高PLGA-γ-PGA NPs细胞摄取能力。采用不同摄取抑制剂对聚合物纳米粒的摄取机制进行研究,结果表明TAT PLGA-γ-PGA NPs借助穿膜肽TAT与细胞表面硫酸乙酰肝素受体相互作用,并通过网格蛋白、小窝蛋白/脂筏介导的内吞摄取入胞,而不经过大胞饮。聚合物纳米载体胞内转运途径研究结果显示,TAT PLGA-γ-PGA NP摄取进入细胞后,胞内转运经过内质网和高尔基体,而不经过溶酶体。以培养21天后的Caco-2细胞单层膜为模型,考察聚合物纳米粒跨膜转运能力。跨膜转运2h后,在共聚焦显微镜下对Z轴进行3D扫描,两种聚合物纳米载体均分布于Caco-2细胞层BL侧,且TAT PLGA-γ-PGA NPs转运量明显多于PLGA-γ-PGA NPs。同时有大量TAT PLGA-γ-PGA NPs跨过了Caco-2单层细胞膜蓄积在transwell聚碳酸脂膜孔道里,而PLGA-γ-PGA NPs只有少量跨过。表明TAT PLGA-γ-PGA NPs的跨上皮细胞屏障的能力要强于PLGA-γ-PGA NPs。本研究第三章以雌性Balb/c小鼠为动物模型,评价了各聚合物纳米粒克服小肠上皮细胞屏障的能力。以DiO和DiI共标记的聚合物纳米载体给小鼠灌胃后,2小时取出十二指肠、空肠和回肠进行切片,在共聚焦显微镜下观察两种聚合物纳米载体在各肠段中的吸收分布情况。结果显示,PLGA-γ-PGA NPs主要分布在肠腔中,小肠绒毛摄取很少;而TAT PLGA-γ-PGA NPs大量吸附于小肠绒毛表面,同时大量被摄取进入小肠绒毛内,分布于黏膜固有层。TAT PLGA-γ-PGA NP在小肠绒毛中摄取的量是PLGA-γ-PGA NP的5-6倍。同时我们发现两种纳米载体均被小肠淋巴派氏结摄取,TAT PLGA-γ-PGA NPs在派氏结中的量是PLGA-γ-PGA NPs的2.2倍。结果表明TAT PLGA-γ-PGA NPs能够高效地跨过了小肠上皮细胞屏障,进入了小肠粘膜固有层和派氏结淋巴系统,增加聚合物纳米粒与消化道免疫系统的相互作用。本研究第四章以雌性Balb/c小鼠为动物模型,对载有免疫原性卵清蛋白(OVA)的聚合物纳米载体在消化道内的免疫反应进行了评价。测定了消化道黏膜免疫所产生的OVA特异性的分泌性IgA(OVA-s IgA)和血液中的OVA特异性抗体Ig G(OVA-sIgG)水平。结果显示聚合物纳米粒可以通过口服的形式,有效地递送疫苗,诱导小鼠产生全身免疫反应和粘膜免疫反应。OAV TAT PLGA-γ-PGA NPs免疫诱导产生的OVA-sIgG和OVA-sIgA量明显高于其他口服组。表明我们设计构建的TAT PLGA-γ-PGA NPs有效地增加了口服疫苗的递送,提高了小鼠全身和黏膜免疫应答能力,为口服疫苗载体的设计提供了有价值的参考。综上所述,OVA TAT PLGA-γ-PGA NPs借助于TAT的穿膜作用,能够高效地跨过小肠上皮细胞屏障,提高了聚合物纳米粒与粘膜固有层和淋巴系统中免疫细胞的相互作用,显著提高了OVA全身和黏膜免疫应答的效应。