论文部分内容阅读
研究背景:乳腺癌(Breast cancer,BC)是全球女性最常见的恶性肿瘤,严重危害着女性的健康。乳腺癌的发生与多种因素有关,包括宿主免疫、遗传因素和环境因素等。研究表明:乳腺癌的发生发展与上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相关。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,这一过程的激活,即可增加了上皮细胞的致瘤能力,同时也是肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)产生的主要机制之一。EMT是乳腺癌发生的最为早期阶段,故研究EMT激活的分子机制、阐明参与这一过程的重要宿主分子,可能为深入认识乳腺癌的发生提供实验依据,并为临床诊断和治疗乳腺癌提供新线索。目的:利用乳腺癌数据库资源、人乳腺癌细胞系和多种实验技术,探究干扰素诱导跨膜蛋白(Interferon induced transmempbrane protein,IFITMs)对乳腺癌细胞的多种生物学行为的影响,包括对乳腺癌细胞EMT、干性以及凋亡、增殖、迁移、侵袭的影响,并进一步探讨IFITM3与PI3K/AKT信号通路的关系在乳腺癌发生中的可能作用机制。利用裸鼠成瘤实验,探讨IFITM3对乳腺癌细胞成瘤能力的影响。方法:本研究首先通过TCGA-BRCA(乳腺浸润癌数据库)分析IFITM3在乳腺癌中的表达。利用实时定量PCR和western blot检测IFITM3在乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中的表达。在此基础上,通过瞬时转染和慢病毒感染,利用两种细胞系建立IFITM3过表达或低表达细胞株,通过western blot、细胞免疫荧光染色、q RT-PCR、划痕实验、平板克隆实验、Transwell实验、乳腺癌成球实验等,检测IFITM3对乳腺癌细胞上皮间质转化、凋亡、迁移、干性等的多种生物学行为的影响。裸鼠种植瘤实验检测IFITM3对乳腺癌细胞体内成瘤能力的影响。结果:1、在乳腺癌中高表达的IFITM3可以促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并抑制其凋亡。利用癌症基因组图谱(TCGA)的乳腺浸润癌数据库(TCGA-BRCA)进行统计分析,数据结果表明:在乳腺浸润癌组织样本(n=1109)中IFITM3表达明显高于正常乳腺样本(n=113),表达变化为1.402倍(P<0.0001),说明IFITM3基因在浸润性乳腺癌组织中升高。通过western blot检测发现,在MCF-7和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞系中,IFITM3呈高表达,且在恶性程度较高的MDA-MB-231的表达水平高于MCF-7,提示IFITM3可能参与乳腺癌的发生发展。利用慢病毒感染建立上调稳定表达的7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞株及其各自对照组Ctrl和下调稳定表达的7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞株及其各自对照组Sh Scramble。利用平板克隆实验检测显示:7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞集落数量及集落大小均大于对照组Ctrl,而7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞集落数量及集落大小均小于对照组Sh Scramble,其差异具有统计学意义(n=3,P<0.05)。上述变化趋势在MDA-MB-231和MCF-7两种细胞是一致的。该结果表明过表达IFITM3可以促进人乳腺癌细胞增殖能力。划痕实验结果显示:MDA-MB-231和MCF-7,划痕处24h、48h、72h的组间距,7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞划痕间距均明显小于对照组Ctrl,而7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞划痕间距均明显大于对照组Sh Scramble,其差异具有统计学意义(n=3,P<0.05);在Transwell迁移实验也显示:7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞组穿膜细胞数明显多于对照组穿膜细胞数,而7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3组穿膜细胞数明显少于对照组穿膜细胞数,其差异具有统计学意义(n=3,P<0.05)。以上实验结果共同证明了IFITM3可以促进人乳腺癌细胞迁移能力。通过western blot检测了代表侵袭能力的蛋白MMP2、MMP9表达量的变化,结果表明:与对照细胞相比,MMP2、MMP9表达量在7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞组中明显增加,而在7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3这两种细胞中均明显减少(n=3,P<0.05)。结合以上穿膜实验和划痕实验,进一步说明IFITM3可促进人乳腺癌细胞侵袭能力。并发现:与对照细胞相比,7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞中抗凋亡蛋白BCL2表达增多,凋亡蛋白PARP(Cleaved)和Bax的表达减少;反之亦然,7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3这两种细胞中,抗凋亡蛋白BCL2表达减少,凋亡蛋白PARP(Cleaved)、Bax表达增多(n=3,P<0.05)。证明IFITM3可以抑制人乳腺癌细胞凋亡能力,这也可能是IFITM3促进乳腺癌细胞增殖的重要原因之一。2、IFITM3可能通过PI3K/AKT信号通路调节乳腺癌细胞的EMT过程和干性。利用western blot检测IFITM3对EMT过程的影响,以典型的上皮细胞标记物E-cadherin和EMT标记物N-cadherin、Snail1、Vimentin、Twist1作为检测指标。结果显示:在7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞中,E-cadherin表达量明显减少,而N-cadherin、Snail1、Vimentin、Twist1表达量明显增多;在7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞中E-cadherin表达增多,而N-cadherin、Snail1、Vimentin、Twist表达减少。与此相一致,细胞免疫荧光染色显示7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞中E-cadherin荧光强度明显减弱,而N-cadherin荧光强度明显增强,7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞中E-cadherin荧光强度增强,而N-cadherin荧光强度减弱,说明IFITM3能够参与至乳腺癌细胞的EMT过程中,进而促进乳腺癌细胞的迁移侵袭能力。Western blot还发现:在7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞中,代表肿瘤细胞干性的标记物ALDH1、OCT4、SOX2蛋白的表达水平均较对照组明显增加,而在7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞中,上述三种蛋白的表达量均较对照组明显减少。成球实验结果也显示:7-up-IFITM3、231-up-IFITM3细胞中形成的乳腺癌细胞球的数量及大小明显高于各自的对照组,而7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞组显著低于各自的对照组(n=3,P<0.05),以上实验结果表明IFITM3的表达水平与乳腺癌细胞的干性呈正相关。利用western blot检测了乳腺癌细胞中IFITM3表达水平对PI3K/AKT信号通路活性的影响。结果显示:与对照组相比,7-Sh IFITM3、231-Sh IFITM3细胞中AKT的表达量无明显变化,而P-AKT(ser473)的表达量减少,证明了下调IFITM3可抑制磷酸化AKT的表达,提示了PI3K/Akt信号通路的活性可能被抑制,从而导致减弱乳腺癌细胞的迁移侵袭和干性以及EMT过程。那么由此推论在乳腺癌细胞中高表达的IFITM3可能通过活化PI3K/Akt促进乳腺癌的疾病进程。3、下调IFITM3抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。裸鼠体内成瘤实验结果显示:接种231-Sh IFITM3细胞的雌性裸鼠的种植瘤生长相对缓慢,形成的种植瘤重量及体积均低于对照组231-Sh Scramble(n=3,P<0.05),证明了下调IFITM3表达后的三阴型乳腺癌细胞MDA-MB-231体内成瘤能力被抑制。提示IFITM3高表达可能成为临床上早期诊断的标志物。结论:(1)IFITM3是诊断乳腺癌的一个重要的癌基因,在浸润性乳腺癌组织和乳腺癌细胞中高表达。(2)IFITM3具有促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及抑制乳腺癌细胞凋亡的生物学特征。(3)IFITM3表达影响着E-cadherin与N-cadherin呈负相关,可促进乳腺癌细胞的EMT过程。(4)IFITM3的表达水平与乳腺癌细胞的干性表达呈正相关。(5)敲低IFITM3可降低PI3K/AKT通路的磷酸化AKT成分,减弱乳腺癌细胞在小鼠体内的成瘤能力,延缓乳腺癌的进展。IFITM3可通过与PI3K/AKT信号通路相互作用实现其对生物学行为特征的调控。