研究背景:肺癌在世界范围内是发病率和死亡率最高的癌症之一。然而目前肺癌的发病机制还不清楚,临床治疗手段有限,并缺乏有效的筛查和早期诊断标志物。肺癌发生是一个复杂的多步骤过程,表现出各种遗传学和表观遗传学异常的分子特征。不正常的表观遗传变化是最常见的分子事件之一,也是肿瘤发生的重要机制。已有研究发现,甲基化特征在某些肿瘤中可以作为早期诊断、预后和筛查的潜在生物标志物。最近,越来越多的证据表明,与肿瘤抑制基因沉默相关的DNA甲基化在肿瘤发生和进展中起着至关重要的作用。因此,从DNA甲基化角度出发,在肺癌发生过程中寻找和鉴定新的有效标志物及肿瘤参与关键基因,可以为肺癌病人的预后评价和建立有效治疗手段提供新的途径。本项目通过前期对全基因组差异甲基化进行筛选和分析确定一个新的优先甲基化基因SOX30。经过文献检索发现,SOX蛋白在多种胚胎和产后发育过程中起着关键作用,如性别决定、神经发育、骨骼发育等,尤其是可以形成肠道和肺等器官的内胚层发育。目前越来越多的证据表明,SOX基因参与了人类各种疾病,特别是恶性肿瘤。这些数据突出了SOX基因在人类疾病发生中的重要性。SOX30作为发育关键基因SOX家族的重要成员被认为与精子分化和精子发生有关,但目前还不清楚SOX30基因是否与肿瘤发生相关。为此,在项目前期研究首次发现SOX30基因可能参与了肺癌发生的基础上,本研究将进一步系统分析SOX30在肺癌中的甲基化调控、主要生物学功能、发挥作用的分子机制以及可能的临床和预后意义。内容和方法:1.SOX30基因在肺癌中的甲基化调控通过全基因组差异甲基化片段进行筛选发现在肺癌组织中优先甲基化基因SOX30,并使用MSP和BSP直接测序在肺癌细胞和组织中进行验证;通过RT-PCR、qRT-PCR、WB和IHC方法分析在不同甲基化肺癌细胞和组织中SOX30表达以确定表达与甲基化的关系,并通过去甲基化实验进行确证,同时采用直接测序排除遗传学突变和缺失的可能,最后进行SOX30甲基化临床特征分析。2.SOX30基因在肺癌中主要的生物学功能通过构建差异表达细胞模型采用MTS、克隆形成、EdU、流式、DNA ladder和transwell等实验分析SOX30对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响;通过构建差异表达移植瘤裸鼠模型分析SOX30对肿瘤形成、生长和远处转移的影响;通过构建化学致瘤和移植瘤基因敲除动物模型分析SOX30对化学诱导成瘤能力和移植瘤肺转移能力的影响;最后,进一步通过构建移植瘤诱导恢复基因敲除动物模型分析SOX30对移植瘤肺转移能力的影响。3.SOX30基因在肺癌中发挥作用的分子机制采用表达谱芯片在转录组水平筛选和分析SOX30可能的下游靶基因和信号通路,并采用qRT-PCR、WB、IHC方法等在差异表达细胞和动物模型中进行验证;在细胞、动物和人群样本中分析SOX30和可能下游靶基因及信号通路相关基因之间的表达关联;生物信息学预测分析SOX30与可能的下游靶基因及信号通路相关基因能否结合;从转录水平采用荧光素酶、ChIP、EMSA和定点突变等实验分析SOX30对下游可能靶基因调控是否通过(直接)结合下游靶基因启动子;从蛋白水平采用Co-IP、FRET和蛋白结构预测等分析SOX30与下游靶蛋白是否存在(直接)相互作用。4.SOX30基因在肺癌中可能的临床和预后意义采用统计学Chi-square检验、Kaplan-Meier和Co-regression法等分析SOX30表达在整个肺癌中的临床特征和预后价值,并进一步分析在不同组织亚型肺癌中SOX30表达的临床特征和可能的预后意义;采用组学和生物信息学网络富集法等从功能差异上分析其在不同组织亚型肺癌中的临床特征和预后意义不同的原因,并进一步分析可能的作用分子机制差异。研究结果:1.SOX30基因在肺癌中的特征性甲基化导致其表达的失活(1)SOX30基因在70.83%(85/120)肺癌组织中发生甲基化,而在8.00%(2/25)癌旁组织和0.00%(0/20)正常组织中发生甲基化,提示SOX30甲基化是肺癌组织的特征性事件;(2)SOX30甲基化与肺癌患者的临床分期明显相关联;(3)SOX30基因甲基化与其转录失活密切相关;(4)去甲基化处理后SOX30基因在肺癌细胞中恢复表达;(5)在肺癌细胞和组织中没有检测到SOX30基因缺失和突变。2.SOX30基因能够显著抑制肺癌的形成、生长和远端转移(1)过表达SOX30能够显著促进肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭;(2)干扰SOX30表达明显抑制肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭;(3)在裸鼠移植瘤中SOX30显著抑制肿瘤的形成和远处转移;(4)Sox30基因敲除小鼠化学诱导致癌过程显著加快;(5)在Sox30敲除小鼠中移植瘤肿瘤形成和生长显著加速;(6)Sox30基因敲除小鼠移植瘤的肺转移速度明显加快;(7)诱导恢复Sox30表达的Sox30基因敲除小鼠肺器官中转移肿瘤数目明显减少。3.SOX30基因通过直接结合启动子转录激活P53及其信号通路下游分子P21、BAX和PMAIP1促进肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖(1)转录组筛选到P53及其信号通路可能是SOX30基因发挥作用的重要下游靶基因或信号通路;(2)SOX30基因能够显著激活P53及其信号通路下游分子P21、BAX和PMAIP1的转录和表达;(3)SOX30基因通过直接结合P53启动子激活P53转录表达,增强其信号通路及其下游分子活性;(4)SOX30基因的HMG-box是其直接结合P53启动子激活其转录表达的必需结构域,而P53启动子的C-C-T-G序列是SOX30结合P53启动子的关键结合位点;(5)P53是SOX30基因发挥促进肿瘤细胞凋亡、抑制增殖和生长作用的下游功能性重要靶基因。4.SOX30基因通过直接结合启动子转录抑制和直接相互作用竞争性结合CTNNB1两种方式抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游分子阻止肿瘤细胞的远处转移(1)转录组筛选到CTNNB1基因及Wnt信号通路可能是SOX30基因发挥作用的另一个重要下游靶基因或信号通路;(2)SOX30基因明显抑制CTNNB1表达和Wnt信号通路活性;(3)SOX30通过直接结合CTNNB1启动子抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游分子MYC、CCND1、MMP7和MMP2等活性;(4)SOX30还通过与CTNNB1蛋白的直接相互作用抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游分子活性;(5)SOX30通过直接蛋白相互作用与TCF竞争性结合CTNNB1抑制Wnt/β-catenin信号活性;(6)SOX30基因C端而非HMG-box是其结合CTNNB1启动子的关键结合区域,而SOX30基因N端是其与CTNNB1蛋白相互作用的关键区段;(7)CTNNB1是SOX30基因发挥抑制肿瘤转移作用的下游功能性重要靶基因。5.SOX30基因在ADC中特异性抑制Wnt信号阻止肿瘤转移并改善病人预后(1)在516例肺癌临床样本中,SOX30表达与患者的组织类型、临床分期和肿瘤转移密切相关;(2)在275例ADC中SOX30表达与患者临床分期、肿瘤转移和肿瘤大小密切关联,而在228例SCC中SOX30表达与病人临床分期、肿瘤转移和肿瘤大小不相关;(3)SOX30蛋白表达与总肺癌患者生存预后没有显著关联,在ADC中是一个独立有利预后因素,而在SCC中是一个独立不利预后因素;(4)在临床早期尤其是临床I期ADC病人SOX30蛋白表达是一个独立的有利预后标志物;(5)在移植瘤裸鼠和敲除动物模型中SOX30表达能显著改善小鼠的生存;(6)SOX30只在ADC中是一个重要的肿瘤抑制基因;(7)在ADC病人组织中SOX30相关基因优先富集转移相关功能通路和Wnt信号通路,而且只在ADC中SOX30与CTNNB1表达负相关;(8)SOX30只在ADC中直接转录抑制CTNNB1阻碍Wnt/β-catenin信号通路及其下游分子活性。研究结论:(1)在肺癌中发现SOX30是一个新的受DNA甲基化直接调控的基因,而且SOX30甲基化在肺癌组织中是一个特有的现象,并与病人临床分期明显相关,提示SOX30甲基化在肺癌中可能是一个潜在的表观遗传生物标志物。(2)SOX30在肺癌中是一个新的关键肿瘤抑制基因,主要通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭控制肿瘤的生长和远处转移。(3)首次发现SOX30通过直接转录激活P53及其下游信号通路发挥促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖/生长的抑癌作用。(4)首次发现SOX30通过直接转录抑制CTNNB1和直接相互作用竞争性结合CTNNB1双重方式抑制Wnt/β-catenin信号通路活性从而阻止肿瘤细胞的远处转移。(5)SOX30表达是ADC患者一个特异的独立有利预后因素,并且仅是临床早期尤其是临床I期病人的一个独立有利预后标志物。(6)SOX30在ADC中能够特异性诱导肿瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移和侵袭,从而阻碍肿瘤形成、生长以及阻止肿瘤转移,最终延长患者的生存时间。本研究发现了肺癌发生、发展和转移一个新的致病机制,并发现SOX30在ADC中特异性的作用、机制以及临床和预后应用价值。本研究将为特定亚型肺癌患者的临床治疗提供新的靶标,并为特定患者预后的精确评估提供了有效检测指标。