MiR-148b调控线粒体分裂在高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的分子机制研究

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目的:探讨高糖培养的人肾小管上皮细胞HK-2微小RNA-148b(miRNA-148b)对其靶基因AMPKα的表达变化,miRNA-148b表达变化对线粒体裂变蛋白DRP1及线粒体形态,线粒体内细胞色素c向胞质释放变化,细胞内活性氧(ROS)产生情况及细胞凋亡情况的影响,探讨高糖诱导肾小管损伤的发病机制,寻找新的治疗靶点.方法:体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,细胞同步化后按如下分组:(1)分为正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30.0 mmo/L葡萄糖)继续观察培养48h后,采用RT-PCR方法检测两组细胞内miRNA-148b的表达变化。(2)转染miR-148b inhibitor抑制miR-148b表达。分为正常糖组、高糖组、阴性对照高糖组(转染阴性对照+30.0 mmo/L葡萄糖)和转染miR-148b inhibitor高糖组(转染miR-148b inhibitor+30.0 mmol/L葡萄糖)培养48h,采用MitoTracker荧光染料在共聚焦显微镜下检测线立体形态变化;采用DCFH-DA荧光探针荧光显微镜下观察各组细胞活性氧产生情况;western blot技术用于检测AMPKα蛋白、DRP1蛋白、Cytochrome c蛋白、cleaved-caspase3蛋白的表达变化;采用Annexin v/FITC荧光染料在流式细胞仪上检测细胞的凋亡情况。结果:(1)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组miR-148b表达显著增高(p<0.01)(2)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组AMPKα蛋白的表达下调,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,AMPKα的表达有所上调,(p<0.05)但仍低于正常糖组。(3)干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组线粒体裂变相关蛋白DRP1表达增多(p<0.05),抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,线粒体裂变相关蛋白DRP1表达减少。(4)干预刺激肾小管上皮细胞培养48h,与正常糖组相比,高糖组细胞线粒体过度分裂,呈短棒状或点状,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,线粒体的过度分裂被抑制,更多的恢复为线状和网状。(5)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组细胞内ROS产生增多,细胞色素C向胞质中释放增多,抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,细胞内ROS产生较减少,细胞色素C向胞质的释放减少。(6)干预刺激肾小管上皮细胞48h,与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达增加(p<0.05),凋亡率增高;抑制高糖状态下miR-148b的表达后,与高糖组相比,肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达减少,(p<0.05)凋亡率减低(p<0.05),。结论:(1)体外高糖条件下培养的人上小管上皮细胞miRNA-148b表达与正常糖组相比显著上调。(2)高糖状态下肾小管上皮细胞miRNA-148b的过表达,下调靶蛋白AMPKα的表达,线粒体分裂相关蛋白DRP1上调,促进线粒体分裂,ROS过度产生,细胞色素C释放,细胞凋亡。转染miRNA-148b inhibitor后可以上调靶基因AMPKα的表达,抑制线粒体分裂,抑制高糖状态下肾小管上皮细胞氧化应激亢进和凋亡,发挥肾脏保护作用,是治疗糖尿病肾病新的潜在靶点。
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