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卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,发病率高,早期临床诊断困难,70%的患者发现时已属晚期。尽管卵巢肿瘤细胞减灭术和化疗水平不断改进,但60%以上的患者最终将复发,晚期卵巢癌的五年存活率仍徘徊在30%左右,目前为止仍然是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,因此寻找一种新的治疗方法十分必要。基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌的基因治疗奠定了基础,成为继放疗、化疗、手术治疗之后的第四种治疗模式。本实验初步探讨了干扰素epsilon和TRAIL基因转染到人卵巢癌细胞的作用,为卵巢癌寻找一种新的基因治疗方法提供了实验依据。第一部分干扰素epsilon基因提取及其真核表达载体构建许多实验表明,在体内外干扰素都能够控制肿瘤生长和抑制肿瘤复发转移。人干扰素epsilon(hIFN-ε)是于2001年Conklin发现的新型Ⅰ型干扰素,已发现具有抗增殖和调节免疫的活性,是一种具有广泛应用前景的新型干扰素。目的:以cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增获得IFN-ε基因,并构建其真核表达质粒PcDNA3.1-IFN-ε。方法:收集人宫颈癌HeLa细胞约3×10~6个,用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,将其中的mRNA反转录合成cDNA第一链,然后再以cDNA为模板通过PCR获得目的基因,其反应产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后,经DNA凝胶回收试剂盒纯化后酶切,回收酶切产物,插入经相同酶切的质粒PcDNA3.1中,连接酶连接过夜,构建成真核表达质粒PcDNA3.1-IFN-ε,通过酶切后电泳鉴定,经测序证实其插入序列的正确性。结果:1、IFN-ε基因的提取:人宫颈癌HeLa细胞的RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,可见在645bp处有一条清楚条带。2、表达质粒的构建:提取重组质粒DNA,经酶切,凝胶电泳,可见两条清楚条带:5.4bp处为PcDNA3.1质粒,645bp处为插入的IFN-ε目的基因,测序证实目的基因IFN-ε以读框融合的方式插入表达质粒PcDNA3.1,并与Genebank中报道的IFN-ε序列一致。结论:本实验提取了基因IFN-ε并成功构建了其真核表达载体,经酶切和测序证实其正确,为进一步研究IFN-ε在卵巢癌细胞中的作用奠定了基础。第二部分TRAIL基因提取及其真核表达载体构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是继TNF和FasL之后的第三个肿瘤坏死因子超家族中重要的新成员,它可以选择性杀伤肿瘤细胞及转化细胞,而对正常细胞几乎没有明显的杀伤作用,这一特殊的选择性使其在肿瘤治疗中具有很广的应用前景。目的:以cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增获得TRAIL基因,并构建其真核表达载体pEGFP-N3-TRAIL。方法:收集急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞约4×10~6个,用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA,将其中的mRNA反转录为cDNA第一链,再以cDNA为模板获得目的基因,其反应产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定后,经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后酶切,回收酶切产物,插入经相同酶切的质粒pEGFP-N3中,连接酶连接过夜,构建成真核表达载体pEGFP-N3-TRAIL,通过酶切后电泳鉴定,经测序证实其插入序列的正确性。结果:1、TRAIL基因的提取:HL-60细胞的RT-PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,可见在865bp处有一条清楚的条带。2、表达质粒的构建:提取重组质粒DNA,经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后,凝胶电泳,可见两条清楚条带:4.7kb为pEGFP-N3质粒,865bp为插入的TRAIL目的基因,测序证实目的基因TTAIL以读框融合的方式插入表达质粒pEGFP-N3,并与Genebank中报道的TRAIL序列一致。结论:本实验成功提取了基因TRAIL并构建了其真核表达载体,经酶切和测序证实正确,为进一步研究TRAIL对卵巢癌细胞的作用奠定了基础。第三部分转染重组质粒对卵巢癌细胞作用的体外研究目的:初步探讨转染真核表达质粒pEGFP-N3-TRAIL和PcDNA3.1-IFN-ε后对卵巢癌细胞的体外作用及其机制。方法:人卵巢癌细胞株SKOV3体外培养达对数生长期时,采用脂质体转染真核表达载体,实验分为六组进行:pEGFP-N3-TRAIL转染组,PcDNA3.1-IFN-ε转染组,两者联合转染组,空质粒pEGFP-N3转染、PcDNA3.1转染组,PBS对照组。采用MTT法测定不同转染组对人卵巢癌细胞的生长抑制作用,流式细胞术观察两者作用于卵巢癌细胞后的细胞凋亡情况,RT-PCR检测不同转染组Survivin的表达水平。结果:pEGFP-N3-TRAIL和PcDNA3.1-IFN-ε转染48小时后,可见卵巢癌细胞体积缩小,细胞间连接减少,细胞内颗粒增多,部分呈悬浮状态;pEGFP-N3-TRAIL转染组细胞内可清楚看到绿色荧光蛋白的表达。转染24h,48h,96h后PcDNA3.1-IFN-ε转染组细胞的生长抑制率分别为14.53%、30.19%、45.05%,明显高于同一时间PcDNA3.1空质粒转染组(3.51%、3.84%、6.95%)和PBS对照组(1.67%、2.49%、3.08%)(P＜0.01);pEGFP-N3-TRAIL转染组细胞生长抑制率分别为18.00%、25.51%、47.43%,明显高于同一时间pEGFP-N3空质粒转染组(5.03%、4.97%、7.60%)和PBS对照组(P＜0.01);pEGFP-N3-TRAIL+PcDNA3.1-IFN-ε转染组的卵巢癌细胞生长抑制率分别为36.68%、56.43%、74.16%,明显高于同一时间两者单独作用(P＜0.01)。结果表明单独转染pEGFP-N3-TRAIL和PcDNA3.1-IFN-ε卵巢癌细胞生长均受抑制,两者联合转染抑制作用加强,并且三个转染组均具有明显的时间效应关系(P＜0.05)。pEGFP-N3-TRAIL和PcDNA3.1-IFN-ε转染组细胞凋亡率分别为21.4%、19.1%,两者联合作用细胞凋亡率为47.3%,较单独转染组细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)。不同转染组在621bp处出现不同亮度的泳带,pEGFP-N3-TRAIL转染组Survivin表达水平较pEGFP-N3转染组和PBS组降低(P＜0.05);PcDNA3.1-IFN-ε转染组Survivin表达水平较PcDNA3.1-IFN转染组和PBS组明显降低(P＜0.01);pEGFP-N3-TRAIL+PcDNA3.1-IFN-ε转染组Survivin表达水平较两重组质粒单独转染组均明显降低(P＜0.01)。结论:转染TRAIL和IFN-ε真核表达质粒均可抑制卵巢癌细胞的生长,诱导其凋亡;一定时间内随着时间延长,细胞生长抑制率呈上升趋势,具有时间效应关系;两者联合明显增加卵巢癌细胞的生长抑制率和凋亡率,具有协同作用;TRAIL和IFN-ε作用于卵巢癌可能与Survivin表达降低有关。