攀西地区药用植物内生及根际放线菌的多样性与抗菌活性研究

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药用植物蕴涵着种类繁多的生物活性物质,为医药、化妆及香料工业提供了丰富的原材料。而存在于药用植物内部的微生物与药用植物在长期进化的过程中,由于二者间不断地进行物质、能量以及遗传信息的交换,内生菌与药用植物最终形成相对稳定的生态关系,使存在于药用植物中的微生物能产生与宿主植物次生代谢产物相同或类似的化合物。攀西地区独特的地理环境和气候条件,适宜多种药用植物生长,药用植物资源有2500种之多,为筛选具有不同生物学活性的新颖化合物提供了丰富的资源。本研究以攀西地区药用植物为研究材料,选择不同的分离培养基,从26种药用植物中分离出内生放线菌560株,根据放线菌的形态特征,将其分为22个群,并从中筛选出60株代表菌株进行多样性和抗菌活性分析。以HaeⅢ、RsaⅠ两个限制内切酶进行16S rDNA-RFLP分析,并根据聚类结果,选取14株代表菌株测定16S rDNA序列,结果表明从攀西地区药用植物中分离得到的放线菌包括了6个属,分别是链霉菌属(Streptomyces)、厄氏菌属(Oerskovia)、野野村菌属(Nonomuraea)、小单孢菌属(Micromonospora)、原小单孢菌属(Promicromonospora)以及红球菌属(Rhodococcus);放线菌株抗菌活性进行初筛结果表明,大多数菌株对11种指示菌都表现出抑菌活性,具有广谱的抗菌活性:同时,对菌株聚酮合成酶(PKS),非核糖体多肽合成酶(NRPS)功能基因簇的筛选结果表明,这两种基因簇在药用植物内生放线菌中广泛存在,同源性分析也显示出较高的多样性。药用植物大多为根部入药,表明其有效成分大多存在于植物根部,存在于药用植物根际的微生物,长期以来受其根系分泌物影响,使得药用植物根际微生物的种类及产生的抗菌物质比例也明显高于非根际微生物。本研究同时以7种采自攀西地区的药用植物为研究材料,结合4种分离方法和7种选择培养基,从药用植物根际中分离出196株放线菌,根据形态特征初步划分为12个类群,选出50株代表菌株,经16SrDNA序列分析,鉴定到属。结果表明从攀西地区药用植物根际中分离到的放线菌包括14个属,分别是链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、野野村菌属(Nonomuraea)、厄氏菌属(Oerskovia)、游动放线菌属(Actinoplanes)、类诺卡菌属(Nocardioides)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、红球菌属(Rhodococcus)、原小单孢菌属(Promicromonospora)、纤维单孢菌属(Cellulomonas)、微球菌属(Micrococcus)、节杆菌属(Arthrobacter)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、分枝杆菌属(Mycobacterium),其中以链霉菌为优势菌群。对11种指示菌的抗菌活性筛选结果表明,链霉菌的抗菌活性明显高于稀有放线菌。应用免培养PCR-DGGE技术研究了7种药用植物根际放线菌的多样性,结果表明,同一采样点不同药用植物根际放线菌的DGGE图谱差异显著,根际放线菌群落结构在不同药用植物的影响下发生了明显的变化。结合可培养与PCR-DGGE分析结果,构建了药用植物长穗兔儿风根际放线菌16SrDNA文库,所获得的50个克隆序列属于32个OTUs,其中53.1%的克隆序列分布于4个放线菌亚纲、5个放线菌亚目、5个放线菌科和6个放线菌属中;44.9%的克隆序列为目前无法培养的类群,形成独立分枝,表明在攀西地区药用植物根际存在着许多新型的放线菌资源。本研究结果表明攀西地区药用植物内生放线菌的多样性及广谱的抗菌活性,为寻找和发掘产生新活性物质的菌株奠定了基础;同时通过可培养与不可培养方法,对药用植物根际放线菌的多样性进行全面的了解,为该地区药用植物放线菌资源的研究和开发,奠定了方法和理论基础。
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