目的:　　 构建NK4基因的原核表达载体pET-26b(+)-NK4，转化E．Coli Rosseta(DE3)并表达。优化NK4蛋白的表达条件制备重组蛋白并通过体外试验观察其活性，为规模化生产NK4蛋白作基础。　　 方法:　　 1．NK4基因重组克隆载体的构建与鉴定　　 以载体pVITRO2-mcs-NK4为模板扩增NK4基因片段，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离特异性产物，DNA胶回收试剂盒回收、纯化NK4基因cDNA并测定浓度。将NK4基因cDNA与载体pMD19-T Simple连接构建重组克隆载体pMD19-TSimple-NK4，转化E．Coli DH5a，行氨苄青霉素和α-筛选。采用菌落PCR、Nde I和SalⅠ双酶切和序列分析等方法，验证目的基因的存在和序列正确性。　　 2．重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4的构建与鉴定　　 转化重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4的E．Coli DH5α行增菌，提取重组载体行NdeⅠ和SalⅠ双酶切。酶切产物经1％低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化，插入经相同双酶切的载体pET-26b(+)。连接产物以冷CaCl2法转化E．Coli Rosseta(DE3)并行卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)筛选，阳性重组菌命名为Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4。重组表达载体用菌落PCR、NdeⅠ和SalⅠ双酶切等方法验证目的片段的存在。　　 3．重组蛋白表达条件的优化　　 1)诱导时间的优化：重组菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4接种于LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素、34μg/mL的氯霉素)，37℃过夜，取1 ml菌液以1：50行扩大培养，至OD260为0．6时加入终浓度为0．5 mmol/L的IPTG，诱导表达5 h。每1 h取样1次，每次80μl，加入20μl5×上样缓冲液，混匀后煮沸5 min，12000 r/min，3 min，行SDS-PAGE分析。　　 2)IPTG浓度的优化：同上增菌后的重组菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4培养物分别加入终浓度为0．1 mmol/L、0．25 mmol/L、0．5 mmol/L、0．75 mmol/L、1．0mmol/L的IPTG，37℃，230 r/min，诱导3 h后取样同上处理行SDS-PAGE电泳分析。　　 3)诱导温度的优化：将同上增菌后的重组菌Rosseta．(DE3)/pET-26b(+)-NK4培养物加入终浓度为0．5 mmol/L的IPTG，分别在16℃、25℃、30℃、37℃，230r/min，诱导3 h后取样同上处理行SDS-PAGE电泳分析。　　 4．Western blot分析　　 重组菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4经IPTG诱导后，超声裂解收集包涵体并洗涤。取洗涤后的包涵体经SDS-PAGE电泳，转膜，加1：500稀释的兔抗人HGF多克隆抗体，4℃过夜。洗膜后加1:1000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG单抗，室温振荡1 h。洗膜后采用DAB试剂盒显色。　　 5．重组蛋白的纯化　　 包涵体的洗涤：称量菌体湿重，以1 g菌：20 mL pH8．0细菌裂解液混匀后超声裂解(400 W，10 s，间隔20 s，300次)，4℃、12000 r/min、10 min，弃上清，沉淀按序用pH8．0包涵体洗涤液A，B液和C液，各3次。6 mol/L盐酸胍溶解包涵体，测定蛋白浓度。　　 Ni-NTA树脂亲和层析法纯化NK4蛋白：以1 mL Ni-NTA树脂:10 mg蛋白挂柱，5倍NTA体积的无咪唑缓冲液平衡(流速30 mL/h)，再用20 mmol/L～200mmol/L咪唑缓冲液连续洗脱(流速15 mL/h)。收集吸收峰值的洗脱液，行SDS-PAGE分析，同时以含其他浓度咪唑的吸收峰值洗脱液作为对照。　　 6．重组蛋白的复性　　 将纯化的重组蛋白用pH8．0复性液进行稀释复性。复性后按序用透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行透析，各3次，每6 h换液1次。以牛血清白蛋白为标准制备标准曲线，采用考马斯亮蓝法测定复性蛋白浓度，真空冷冻干燥后-70℃保存。　　 7．重组蛋白体外活性测定　　 重组蛋白作用于Hela细胞，观察其对后者的贴壁、迁徙和凋亡等的影响。在Hela细胞培养物中加入重组蛋白(7μg/mL)，常规培养，观察重组蛋白对细胞贴壁(培养1．5 h)和凋亡(培养24 h)的影响，以加入等量PBS的Hela细胞组作为对照。无菌盖玻片平放于6孔板中部，加入Hela．细胞，常规培养，待其贴壁后将盖玻片取出，培养板底部出现边界整齐的无细胞空白区。加入重组蛋白(7μg/mL)，常规培养24 h后观察重组蛋白对Hela细胞迁徙的影响，以加入等量PBS的Hela细胞组作为对照。　　 结果:　　 1．NK4基因克隆载体构建与鉴定　　 NK4基因cDNA与载体pMD19-T Simple连接后成功构建重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4，转化E．Coli DH5α，筛选出阳性菌落。将菌落直接PCR产物、NdeⅠ和SalⅠ双酶切产物、重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4提取物同时电泳，可见与目的片段大小相似的特异性条带(1359 bp)，提示重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4成功构建。　　 取纯化的重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4，采用双脱氧链末端终止法行双向测序，序列测定结果证实重组于载体NK4基因片段序列正确。　　 2．重组原核表达载体pET-26b(+)-NK4的构建与鉴定　　 将经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后回收的重组克隆载体pMD19-T Simple-NK4和pET-26b(+)的目的片段连接，成功构建重组表达载体pET-26b(+)-NK4，转化E．ColiRosseta(DE3)，筛选出阳性菌落。将阳性菌落直接PCR产物、NdeⅠ和SalⅠ双酶切产物、重组载体pET-26b(+)-NK4提取物和未酶切重组载体pMD19-T Simple-NK4同时电泳，可见与目的片段大小相似的特异性条带(1359 bp)，提示重组表达载体pET-26b(+)-NK4获构建成功。　　 3．重组蛋白表达条件优化结果　　 诱导条件优化实验表明，当重组菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4经0．5mmol/L IPTG诱导3 h后重组蛋白达最高水平，延长诱导时间未能促进其表达(图3A)；重组菌经各浓度IPTG诱导3 h后发现组间重组蛋白表达量无明显差别(图3B)；重组菌在含0．5 mmol/L IPTG的LB培养基中置4种温度诱导3 h，发现37℃组重组蛋白表达量最高(图3C)。Western blot证实重组菌经诱导后产生的50 kDa的重组蛋白为NK4蛋白(图3D)，提示重组菌Rosseta(DE3)/pET-26b(+)-NK4能表达NK4蛋白。　　 因此，以37℃，0．5 mol/L IPTG诱导3 h作为NK4重组蛋白表达的诱导条件。　　 4．Western blot分析　　 洗涤后的包涵体经Western blot鉴定后，在分子量大约50 kDa处有特异性的条带，提示重组蛋白为NK4蛋白。　　 5．重组蛋白的纯化　　 将溶解的包涵体蛋白挂Ni-NTA柱后用梯度浓度咪唑缓冲液洗脱，取洗脱液测定纯度并行SDS-PAGE电泳，采用Bradscan凝胶图像分析软件分析洗脱效果。结果提示60 mmol/L咪唑缓冲液洗脱的重组蛋白的浓度与纯度(95％)均理想，采用其他浓度咪唑缓冲液洗脱效果不佳。　　 6．重组蛋白的复性　　 纯化后的蛋白经稀释复性后，在用透析液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行透析的过程中有少量蛋白析出，为变性的NK4蛋白，离心后上清行SDS-PAGE电泳可见特异性目的条带。　　 7．重组蛋白活性测定　　 以含7μg/mL复性重组蛋白的Hela细胞培养物为观察组，以加等量PBS的Hela细胞为对照。结果发现：培养1．5 h后，对照组细胞已贴壁且形态呈梭型或不规则而观察组细胞形态仍为圆形，未发现贴壁生长：培养24 h后，观察组细胞数量少，可见较多的凋亡细胞，而对照组细胞生长理想，凋亡细胞少见;细胞迁徙试验发现，培养24 h后观察组细胞迁徙较对照组明显受抑制。　　 上述结果提示NK4蛋白复性成功，且保留了生物学活性。　　 结论:　　 成功构建了 NK4的原核表达载体pET-26b(+)-NK4。转化重组表达载体pET-26b(+)-NK4的E．Coli Rosseta(DE3)以包涵体形式大量表达重组蛋白，约占总蛋白的42％；经纯化后的重组蛋白纯度可以达95％以上；复性后的NK4蛋白可以抑制Hela细胞的贴壁、迁徙运动并能诱导Hela细胞的凋亡。