基于酵母浸出物筛选血清替代物的研究

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目的:  建立酵母浸出物中内毒素的检测方法,为酵母浸出物应用于无血清培养基的研究提供指导,并在此基础上,筛选出适合动物细胞生长的培养基血清替代物。  方法:  以安琪酵母股份有限公司生产的试剂级的酵母浸出物 FM 902 为试验对象,依据《中华人民共和国药典》和国家食品药品监督管理总局发布的《细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验》行业标准的相关规定要求,采用干热程序有效性试验、灵敏度复核试验、FM 902凝胶法干扰试验和FM 902凝胶半定量试验,检测酵母浸出物中内毒素的含量;以贴壁CHO细胞为研究对象,通过CCK-8法筛选 4种酵母浸出物和11种细胞因子,确定适合CHO贴壁细胞生长的无血清培养基或低血清培养基;以HEK 293细胞为研究对象,采用批培养方式,检测各种酵母浸出物对悬浮细胞生长的作用效果。  结果:  通过干热程序有效性试验、灵敏度复核试验、FM 902凝胶法干扰试验和FM 902凝胶半定量试验,测得FM 902浸出物中所含内毒素为5 EU/mg,符合《中华人民共和国药典》(2015 版)的限量标准。试验结果表明在无血清培养基中,适当添加酵母浸出物FM 902是可行的;通过对不同酵母浸出物FM888、FM502、YI0201、FP103和细胞因子的筛选,确定了两种对贴壁CHO细胞生长有促进作用的酵母浸出物:FP 103和酵母浸出物复配物(FM 888、YI 0201),且浓度分别为1 g/L和0.125 g/L。同时确定了表皮生长因子和转铁蛋白是贴壁细胞 CHO 细胞生长所必需的重要添加物,可以替代血清浓度到0.5%FBS,且浓度分别为1 ng/mL和10 mg/L;采取批培养方式,每隔24 h测悬浮细胞HEK293的活细胞密度,监测其细胞活率,得出Angelyeast公司的酵母浸出物FP 103为最佳添加物,且最佳浓度为3 g/L。  结论:  1. 安琪酵母浸出物中内毒素含量符合《中华人民共和国药典》(2015版3部)的限量标准,可以作为无血清培养基添加物;  2. 维持CHO细胞生长的初步配方为:基础培养基(DMEM/F12)+ FP103+表皮生长因子+转铁蛋白+酵母浸出物复配物(FM888、YI01),此配方可以使CHO细胞传代两代;  3. 安琪酵母浸出物FP 103为促进悬浮细胞HEK 293的最佳添加物。
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