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脑卒中(Stroke),又称中风,是一种严重威胁人类健康的脑血管疾病,具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点。缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS),是脑卒中最常见的类型,已成为研究的热点和大多数药物试验的目标。脑缺血后,血液及周围组织释放的有害物质会对脑产生损伤,即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)。国内外众多研究表明,炎症在CIRI中起到重要的作用,但其潜在机制尚未完全阐明。近年来,NLRP3(nucleotide binding domain(NOD)-like receptor protein 3)炎性小体在IS中的作用受到越来越多的关注。NLRP3炎性小体能够感知各种刺激,形成半胱天冬酶-1(Caspase-1)活化的分子平台,进而处理和释放白介素-1(interleukin-1,IL-1)和IL-18,增强炎症反应。失笑散是中医临床常用的活血化瘀方剂,具有活血化瘀、散结止痛的功效,但其对于CIRI的研究尚未见报道。故本研究拟通过构建体内外CIRI模型,以失笑散提取液进行干预,探讨失笑散对体内外CIRI的保护作用及其机制。目的:建立大鼠脑缺血再灌注损伤(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型和BV2细胞氧糖剥夺再灌注(OGD/R)模型,分别以失笑散药物水煎液及提取液进行干预,探究失笑散对体内外CIRI的保护作用及可能的潜在机制。方法:(1)体内实验:选择清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,以线栓法建立MCAO模型。大鼠随机分为假手术组、模型组、失笑散水煎液低、中、高浓度治疗组,每组15只。在造模前灌胃给药,每日两次,连续给药5天。造模24小时后,进行神经功能评分,然后将大鼠麻醉后处死,收集缺血脑皮质及外周血。1、TTC染色测定脑梗死体积;2、实时定量 PCR 检测大鼠缺血脑皮质中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA的表达。3、ELISA法检测大鼠缺血脑皮质及血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。(2)体外实验:将BV2细胞分为对照组,模型组(OGD/R组)及失笑散提取液处理组。用不同浓度的提取液预处理BV2细胞2小时后,缺氧处理4小时。对照组以正常培养基培养,不给药,不进行OGD;模型组不给药,与药物组同时进行OGD,缺氧结束后重新复氧24小时,收集细胞上清与细胞裂解液检测。1、CCK-8法检测BV2细胞活力值;2、流式细胞仪检测BV2细胞凋亡比例;3、实时定量PCR检测BV2细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IIL-18、TNF-α mRNA的表达。4、ELISA法检测BV2细胞上清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 的表达。结果:1、神经功能评分结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠得分显著升高(P<0.001),三组失笑散治疗组大鼠的神经功能评分则显著降低(P<0.01、P<0.01、P<0.01),但三组两两之间无明显差异。2、TTC染色:与假手术组相比,模型组大鼠脑皮质梗死面积为49.8%(P<0.001,),而失笑散低、中、高浓度组大鼠脑部梗死面积分别为19.6%、15.4%、4.1%,明显缩小(P<0.001、P<0.001、P<0.001),高浓度结果明显优于低、中浓度组组。3、ELISA结果显示,与假手术组对比,模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子表达明显增加(P<0.001、P<0.01、P<0.01、P<0.01),脑皮质中炎症因子表达也明显增加(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.001)。而且,与模型组对比,失笑散治疗组大鼠血清中炎症因子表达减少(P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.05),但组间无明显差异,脑皮质中炎症因子表达明显下降(P<0.001),但组间差异不显著。4、RT-PCR法检测大鼠缺血脑缺血组织中炎症因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA的表达水平。结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠缺血脑缺血组织中炎症因子表达水平显著上升(P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001),与模型组相比,失笑散能明显降低炎症因子表达水平(P<0.001、P<0.01、P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001),但无明显组间差异。5、使用CCK-8法检测BV2细胞活力值。结果显示,与空白组相比,不同浓度失笑散干预的BV2细胞活力值无明显变化,各组之间无明显差异,提示失笑散提取液无明显细胞毒性。6、采用流式细胞仪检测BV2细胞凋亡。结果发现,与对照组相比,模型组细胞凋亡比例显著增大(P<0.01),与模型组相比,失笑散能减少BV2细胞凋亡(P<0.05)。7、ELISA法检测BV2细胞上清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的表达。ELISA结果显示,与空白对照组相比,模型组细胞上清中炎症因子表达增多(P>0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.001),与模型组相比,失笑散能降低炎症因子表达水平(P<0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.001),但各治疗组间无明显差异。8、采用 RT-PCR 检测 BV2 细胞 NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA的表达。从PCR结果看出,与假手术组相比,模型组细胞NLRP3、Caspase-I、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA 的表达升高(P>0.05、P<0.05、P<0.001、P<0.05、P<0.05、P<0.01)与模型组相比,失笑散提取液能降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-αmRNA 的表达(P>0.05、P<0.01、P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.01),但组间差异不明显。结论:失笑散可改善神经功能,缩小脑梗死面积,降低大鼠缺血脑组织及血清中炎性因子的表达;失笑散提取液可保护OGD/R模型BV2细胞,减少细胞凋亡及细胞中炎症因子的表达;失笑散对缺血再灌注损伤的保护作用可能与调控NLRP3介导的炎症信号通路有关。