猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)隶属于分节段的单股负链RNA病毒正黏病毒科,除能感染猪体外,还具有感染人类的跨种间传播能力。病毒基因组为分节段的8条单股负链RNA,编码PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、 M2、NS1及NEP(NS2)等10种以上蛋白。目前关于流感病毒跨种间感染的机制研究较少。本研究以SIV感染人肺上皮细胞A549为模型,应用亚细胞蛋白组学方法对SIV感染细胞的蛋白表达变化进行了探索。1、SIV编码蛋白的亚细胞定位采用纯化病毒、Ni2+亲和纯化的原核表达蛋白NP、NS1、M1为免疫原,免疫BALB/c小鼠、新西兰大白兔,分别获得了NP蛋白单克隆抗体分泌细胞3株、M1蛋白单克隆抗体分泌细胞6株、NS1蛋白单克隆抗体分泌细胞6株及兔抗NP、NS1、M1蛋白多克隆抗体。采用荧光双标法,以制备的抗体为工具,分析了H3N2、H1N1SIV及A/PR8/34/H1N1(PR8)感染A549细胞24小时后的病毒蛋白NP、NS1和M1的亚细胞定位及病毒蛋白之间的定位关系。结果显示,H3N2、H1N1SIV(?)口PR8的NP蛋白主要集中分布于感染细胞的核内,但胞质中也有分布。SIV的M1蛋白在感染细胞的胞核、胞质均有表达,但PR8的Ml蛋白仅呈点状分布于细胞核内。SIV的NS1蛋白主要集中分布于感染细胞的核内,PR8的NS1蛋白呈点状分布于细胞核和细胞质。共定位分析显示,仅在H3N2、H1N1SIV感染细胞的核内发现NS1与NP的共定位关系。这些数据说明,两个不同亚型SIV的NP蛋白与PR8的NP蛋白亚细胞分布相同,但Ml和NS1蛋白的亚细胞分布存在差异。2、SIV感染细胞的胞质/胞核亚细胞蛋白质组分析以人肺上皮细胞A549感染猪流感病毒H3N2为感染模型,采用2-DE结合MS研究方法分析细胞感染后24小时的细胞质、细胞核亚细胞蛋白质组表达变化动态。MALDI-TOF/TOF质谱分析结果表明,胞质、胞核组分共有56个差异蛋白点(对应43种蛋白)被鉴定成功(蛋白分数大于67,p<0.05)。其中细胞质组分中对应19个上调蛋白点和15个下调蛋白点,细胞核组分中包含14个上调点和8个下调点。差异蛋白的生物功能学分析表明,SIV感染主要涉及到细胞死亡、压力应答、脂类代谢、信号转导及RAN转录和修饰方面。蛋白相互作用网络(IPA)分析表明,H3N2SIV感染主要激活NF-κB-IFN通路。同时通过对比H1N1SIV感染,利用免疫印迹(WB)和免疫荧光(IFA)验证了差异蛋白的变化规律,发现细胞蛋白WARS、IFI35、HSPB1、NMI、GNB1、GNB2等在病毒感染后有表达上调及入核的表现。免疫共沉淀分析显示NS1与hnRNP C2存在相互作用关系。siRNA干扰和瞬时过表达分析显示,与SIV H1N1感染细胞相比,WARS蛋白对SIV H3N2的M1、NP蛋白的合成量及病毒载量有明显影响。3、SIV感染细胞的线粒体蛋白组学分析线粒体作为真核生物细胞内最重要的一种亚细胞器,参与了细胞凋亡、能量代谢、应激反应及免疫应答等许多方面。为了分析H3N2亚型猪流感病毒感染A549细胞后线粒体的应答反应,本研究采用2-DE结合MS鉴定方法,分析了SIV H3N2感染A549细胞后24小时的线粒体蛋白组变化。2-DE凝胶的比较分析表明,感染前后线粒体蛋白共有29个蛋白点发生了差异表达,包括上调蛋白点16个,下调蛋白点13个。MALDI-TOF/TOF质谱成功鉴定26个差异蛋白点(蛋白分数大于67,p≤0.05),对应12种上调蛋白,11种下调蛋白。差异蛋白的生物学功能分析表明,H3N2病毒感染涉及细胞形态、免疫应答及信号转导蛋白的表达变化。差异表达蛋白的network网络和pathway通路分析结果表明,氧化磷酸化通路(Oxidative phosphorylation)、整联蛋白信号通路(1ntegrin signaling)是线粒体应答细胞感染的主要通路。实时荧光定量RT-PCR对SIV H3N2感染后24h的16个细胞差异表达蛋白的转录本分析表明,RNA加工及蛋白表达类基因、细胞死亡相关基因均是上调表现；细胞间信号转导类基因以上调为主;细胞蛋白组装类基因以下调为主；能量合成类基因的变化不大。综合以上信息,发现干扰素诱导表达蛋白Mx1,热休克蛋白等在三组分中均有明显上调,WARS在胞质、胞核组分中上调,hnRNP H家族蛋白在细胞核中上调,而在线粒体中下调。因此,本研究揭示的病毒感染后亚细胞蛋白质组信息为进一步开展SIV跨种间感染的分子致病机制奠定了基础。