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神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)以四聚体形式嵌在流感病毒表面，是重要的功能蛋白，可切割唾液酸(Sialic acid，SA)促进子代病毒的释放，是抗流感病毒药物的重要靶点。现有以NA为靶点的药物均是SA类似物，通过竞争结合病毒表面NA而抑制其活性，进而阻断子代病毒的释放。 甲型H7N9流感病毒[A/Hangzhou/1/2013(H7N9)，简称H7N9]是首个确认的可感染人的H7N9毒株，于2013被分离发现，本研究以其神经氨酸酶为研究对象，建立了野生NA酶水平药物评价模型，并比较了扎那米韦和奥司他韦对此株病毒与H1N1、H3N2和H5N1的药效学。流感病毒耐药是治疗病毒性流感的难点，确认药物对突变病毒的敏感性有助于临床用药。达菲是抗流感病毒的储备药，临床出现的达菲耐药病毒最常见突变位点是H274Y和R292K（根据N2亚型序列确定编号）。据此，本研究建立了NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K酶活性评价模型，并应用模型检测了扎那米韦和奥司他韦药效学。此外，在实验室前期工作基础上，本研究重复了以流感病毒[A/California/04/2009(H1N1)，简称CA/04]和[A/Puerto Rico/8/34/MountSinai(H1N1)，简称PR/8]神经氨酸酶为靶点的野生酶水平药物评价模型，并在获得流感病毒[A/Wyoming/03/2003(H3N2)，简称WY/N2]、[A/W SN/1933(H1N1)，简称WS/33]和[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)，简称VN/04]神经氨酸酶质粒的基础上，完善了这些毒株的野生NA酶水平药物评价模型。 模型经阳性药验证，结果显示扎那米韦对神经氨酸酶的半数抑制浓度(The halfmaximal inhibitory concentration， IC50)分别为NAH7N9-WT:1.1±0.1 nmol·L-1;NAH7N9-H271Y:1.4±0.2 nmol·L-1;NAH7N9-R289K:38.0±5.9 nmol·L-1; NACA/04-WT:0.3±0.1nmol·L-1; NAPR/8-WT:0.3±0.1 nmol·L-1; NAWY/N2-WT:1.1±0.4nmol·L-1; NAWS/33-WT:0.4±0.1 nmol·L-1; NAVA/04-WT:0.8±0.1 nmol· L-1;奥司他韦羧酸盐对神经氨酸酶的IC50分别为NAH7N9-WT:1.6±0.6 nmol·L-1; NAH7N9-H271Y:15.1±2.6 nmol·L-1;NAH7N9-R289K:大于1000.0 nmol·L-1。结果表明:(1)扎那米韦对NAH7N9-WT的抑制活性与其他毒株相当，提示该药物能有效抑制野生H7N9流感病毒，可用于治疗携带该病毒的病人;(2) NAH7N9-R289K病毒对扎那米韦和奥司他韦均耐药，耐药倍数分别为34倍和大于625倍，提示当病人感染该突变病毒时建议停止使用这2种药物;(3)NAH7N9-H271Y病毒对扎那米韦和奥司他韦均不耐药，提示临床出现该突变毒株的可能性较小。 唾液酸类似物结构特征的神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase Inhibitor，NAI)是临床一线抗流感病毒药物，其缺点是容易产生耐药病毒和引起较严重神经精神异常副作用(Neuropsychiatric Adverse Events，NPAEs)。流感病毒为RNA病毒，基因在复制过程中易发生突变，在药物存在下，产生耐药突变的病毒可存活并繁殖。由于现有NAI均是唾液酸类似物，导致NA耐药突变位点相似，临床表现为交叉耐药及多药耐药性。NA在生物中广泛存在，人体内不同组织和器官中也存在着组成性的神经氨酸酶家族。扎那米韦和奥司他韦等作为SA类似物也可与人体组成性NA结合并抑制其活性，影响其正常生理功能，产生药物副作用，临床表现为幻觉、行为异常、惊厥和精神错乱等，降低患者生活质量。因此，出于减少耐药和避免NPAEs双重考虑，寻找非底物类似物的神经氨酸酶抑制剂具有重要意义。 本研究以成药库为基础寻找新型非SA类似物的神经氨酸酶抑制剂。首先应用野生高致病流感毒株[A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)]NA酶学模型评价了1600个上市药物，获得药物终浓度为10-4 mol·L-1，抑制率≥60％的活性化合物40个。然后综合这些药物原适应症、作用靶点、机制、副作用以及血药浓度等信息，从中挑出12个药物，评价了它们对NAPR/8-WT的影响，最终得到4个较优药物:利福平、盐酸非那吡啶、柳氮磺胺吡啶和原卟啉Ⅸ。结果显示它们对NAH7N9-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、90.6μmol· L-1（盐酸非那吡啶）、77.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和38.6μmol· L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAH7N9-H271Y的IC50分别为大于100μmol-L-1（利福平）、大于100μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、88.5μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和大于100μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAH7N9-R289K的IC50分别为99.8μmol·L-1（利福平）、91.4μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、57.8μmol· L-1（柳氮磺胺吡啶）和61.0μmol-L。1（原卟啉Ⅸ）;对NACA/04-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、94.3μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、97.5μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和54.5μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAPR/8-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、大于100μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、90.8μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和43.0μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAWY/N2-WT的IC50分别为大于100μmol-L-1（利福平）、69.7μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、85.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和69.9μmol·L-1(原卟啉Ⅸ）;对NAWS/33-WT的IC50分别为98.7μmol·L-1（利福平）、94.4μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、75.6μmol-L-1（柳氮磺胺吡啶）和51.2μmol· L-1（原卟啉Ⅸ）;对NAVN/04-WT的IC50分别为大于100μmol·L-1（利福平）、90.8μmol·L-1（盐酸非那吡啶）、86.8μmol·L-1（柳氮磺胺吡啶）和54.8μmol·L-1（原卟啉Ⅸ）。 本论文还评价了天然产物单体、化学合成或生物合成来源的小分子化合物236个，结果发现了1个活性化合物(WB813)，其对神经氨酸酶的半数抑制浓度分别为:NACA/04-WT:15.6μmol·L-1; NAP/8-WT:58.0μmol·L-1; NAWY/N2-WT:6.3μmol·L-1;NAWS/33-WT:66.9μmol·L-1; NAVN/04-WT:13.2μmol·L-1，对NAH7N9-WT、NAH7N9-H271Y和NAH7N9-R289K抑制活性较低，IC50均大于100μmol·L-1。 综上所述，本论文首先构建了2013年人感染H7N9流感毒株野生NA酶水平药物评价模型，然后预测并建立了两种奥司他韦耐药型突变NA酶活性评价模型，研究结果可为临床治疗携带野生或突变H7N9病毒的病人提供参考。本研究还重复和完善了以其他株甲型流感病毒NA为靶点的酶水平药物评价模型，应用模型对包含1600个上市药物的成药库和236个小分子化合物进行筛选，最后得到了5个活性化合物，值得注意的是其中4个化合物都不是SA类似物，为新型NAI的设计和寻找提供思路。