目的:黄曲霉毒素B1(AFB1)广泛内暴露可能是广西肝癌高发的原因之一。以往的流行病学研究数据显示广西肝癌具有地区聚集性。这种聚集性的产生是否与AFB1的内暴露水平和暴露时间长短的差异有关。针对AFB1外暴露的干预措施不一定对降低AFB1内暴露水平有效,要达到降低肝癌发病率的目的,降低人群AFB1内暴露水平才是有效的。因此对广西境内人群AFB1内暴露水平进行动态把控对降低肝癌发病率具有非常重要的现实意义。本文以广西壮族人群出生缺陷队列为研究对象,检测不同地区孕妇血清样本中AFB1的内暴露水平,收集孕妇人群中AFB1内暴露数据,分析广西境内不同地区孕妇AFB1内暴露水平的差异,为制定合理有效的社区AFB1内暴露干预措施提供可靠科学证据。除此而外,考虑到个体对AFB1内暴露的敏感性差异,从分子水平探讨AFB1的生物效应也是制定经济有效的干预措施所必须考虑的。为了寻找对孕妇提供早期保护的措施,本研究还探讨了AFB1内暴露对机体的生物效应。主要通过对NCBI GEO公共数据库中AFB1在非细胞毒性浓度下处理诱导多功能干细胞(iPSC)衍生的人肝细胞转录谱数据进行生物信息学分析,以期从中寻找可靠生物标志物,并纳入特殊人群(孕妇)的公共卫生检测体系。方法:1、流行病学基础数据与血清样本收集:2016年至2017年,广西医科大学仇小强教授在国家自然科学基金支持下建立了广西壮族人群出生缺陷研究队列,该项目按课题设计严格选择壮族人口占90%以上的德保县、靖西市、隆安县、平果县和田东县5个壮族人群聚居县市为研究目标人口,根据严格的纳入标准进行样本人群筛选。在孕妇签署知情同意书后,完成了流行病学基线(包括母亲的基本情况、妊娠情况、饮酒吸烟等生活习惯,同时确保资料的准确,保证随访工作能通过记录特征识别信息,在新生儿出生后,能准确地从医院系统查看其个人相关资料以及对妊娠结局进行调查)调查和血清样本收集。本研究的信息与样本均来源于广西壮族人群出生缺陷研究队列项目收集的信息与样本。2、实验研究:采用人AFB1白蛋白(AFB1-alb)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒,双抗体夹心法测定标本中人AFB1白蛋白(AFB1-alb)水平。用纯化的人AFB1白蛋白(AFB1-alb)捕获抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被的微孔中依次加入人AFB1白蛋白(AFB1-alb),再与HRP标记的检测抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人AFB1白蛋白(AFB1-alb)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人AFB1白蛋白(AFB1-alb)含量。3、生物信息学分析:从NCBI GEO公共数据库以AFB1为关键词进行检索,获得芯片表达矩阵,通过GO数据库、KEGG数据库等富集分析,进行差异表达分析,进一步以加权基因共表达网络分析进行探索。结果:1、根据纳入排除标准,共收集到994名孕妇问卷、出生结局及外周血血清样本,其中来源于德保县78名,靖西市385名,隆安县191名,平果县170名,田东县170名。孕妇的职业为农民有486名,占所有职业的48.89%。孕妇的年龄分为4个组别,其中25-29岁年龄组人数最多,占31.39%。在孕前或孕早期没有服用叶酸人数较多,占87.53%。在孕期饮酒的人数和使用化妆品产品的人数相近,分别为45名和63名。在孕期吸烟或被动吸烟的人数较多,占72.43%。平时有进行规律运动的孕妇占40.14%。2、在收集到的出生结局信息里,男婴有522名,女婴有472名,其中是阴道自然分娩的婴儿有690名,占69.42%。在所有婴儿里,早产儿有58名,占5.84%。经过医院的ARPG评分,其中有出现窒息情况的婴儿有15名,占1.51%。出生体重为正常标准的婴儿有920名,占92.56%。第一次怀孕的孕妇有195名,占19.62%;而第一次活产的孕妇有355名,占35.71%。在胎儿娩出后24小时内出血量超过500ml的有48名,属于产后出血,占4.83%。3、通过酶联免疫实验,检测出孕妇外周血血清AFB1白蛋白加合物浓度(pg/ml),平均值为559.25 pg/ml,中位值为550.44 pg/ml,最小值为356.42pg/ml,最大值为814.84 pg/ml。以五个地区为分组,进行方差分析,方差齐性检验,P=0.058,说明方差齐;单因素方差分析,F=1.957,P=0.099,说明五个地区之间孕妇AFB1内暴露无统计学上的差异。4、通过Logistic回归模型分析结果显示,影响孕妇AFB1内暴露的因素包括:年龄(OR=1.210,95%CI=1.061-1.380),孕期是否吸烟或被动吸烟(OR=5.149,95%CI=3.732-7.104)。研究结果还显示,职业、孕前或孕早期是否服用叶酸、孕期是否饮酒、孕期是否使用化妆产品、平常是否进行规律运动,差异均无统计学意义(P>0.05)。5、根据孕妇外周血血清AFB1白蛋白浓度的中位值作分界,高于中位值作AFB1高暴露组,低于中位值作AFB1低暴露组,以这两组暴露情况与出生结局作比较,结果显示,孕次、产次、产后出血量(ml)及胎儿娩出方式,差异有统计学意义(P<0.05)。性别、ARPG评分、出生体重(g)及出生孕周,均无统计学差异(P>0.05)。6、从GEO数据库获得GSE127791芯片表达矩阵,共有3个实验样本和3个对照样本选入分析集。通过GO数据库、KEGG数据库等富集分析,进行差异表达分析,通过对所得结果的加权基因共表达调控网络分析、基因富集分析,鉴定了25个基因模块,找出了功能相似性最高的green、tan、salmon三个模块。结论:1、被检壮族孕妇AFB1内暴露普遍存在,且无地区差异。胎儿期的AFB1内暴露差异与肝癌的发病率关系有待深入跟踪研究。孕妇AFB1内暴露水平与年龄(OR=1.210,95%CI=1.061-1.380)和孕期是否吸烟或被动吸烟(OR=5.149,95%CI=3.732-7.104)因素是孕妇AFB1内暴露的危险因素。在出生结局中发现,孕妇的产后出血量与AFB1内暴露水平有统计关联,研究显示AFB1内暴露可能会增加孕妇产后出血。2、暴露于AFB1的基因毒性效应短期体外实验中表现出了复杂的基因调控模式,可以为临床检验AFB1对机体毒性及评估AFB1内暴露风险提供线索,这也表明了转录组学在体外快速筛选致癌物方面能发挥重要作用。通过生物信息学分析,AFB1对机体毒性与小分子应激、细胞周期、p53相关蛋白等功能相关,进一步阐释了AFB1的致病机理,也为探究AFB1内暴露下细胞应激水平上的生物标志物提供了理论基础,为将来的应用提供生物信息学上的证据。