【摘 要】
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捻转血矛线虫病呈全球性分布,在国内外广泛流行,是当前反刍动物最为易感的消化道寄生虫病之一。目前我国对于该病的防控主要依赖于驱虫药物的使用,而长期不合理的使用驱虫药物导致了捻转血矛线虫单耐药株甚至多重耐药虫株的出现,极大增加了防控难度。该病的肆虐严重制约畜牧业的健康发展,因此寻求新的药物靶标或合适的疫苗候选分子对于捻转血矛线虫病的防控迫在眉睫。CAP蛋白家族（Cysteine-rich secret
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.31872462）捻转血矛线虫H11糖蛋白复合物糖基化修饰特征及其对免疫保护作用的影响
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捻转血矛线虫病呈全球性分布,在国内外广泛流行,是当前反刍动物最为易感的消化道寄生虫病之一。目前我国对于该病的防控主要依赖于驱虫药物的使用,而长期不合理的使用驱虫药物导致了捻转血矛线虫单耐药株甚至多重耐药虫株的出现,极大增加了防控难度。该病的肆虐严重制约畜牧业的健康发展,因此寻求新的药物靶标或合适的疫苗候选分子对于捻转血矛线虫病的防控迫在眉睫。CAP蛋白家族（Cysteine-rich secretory proteins,Antigen 5 and Pathogenesis-related1,CAP）在原核生物和真核生物中广泛存在,其蛋白种类繁多且功能复杂。最近基于捻转血矛线虫基因组学和转录组学分析表明,在捻转血矛线虫中存在大量的CAP蛋白分子,但其确切功能尚未解析。因此,本研究从CAP蛋白是否能够调节虫体生长发育的功能研究入手,从已报道的捻转血矛线虫的CAP分子中选取Hc-CAP-15、Hc-CAP-17为研究对象,利用转录水平分析、免疫组化及RNAi等实验方法,初步探求该类分子在捻转血矛线虫生长发育过程中的调控作用。（1）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17编码序列的扩增及蛋白序列分析根据捻转血矛线虫基因组数据,通过设计合成特异性引物,扩增获得Hc-cap-15和Hc-cap-17的编码区序列。随后通过氨基酸序列比对和进化树分析表明捻转血矛线虫Hc-CAP-15、Hc-CAP-17均具备由四个CAP基序构成的CAP结构域及保守的半胱氨酸残基,表明二者均为典型的单结构域CAP蛋白。（2）Hc-cap-15和Hc-cap-17在捻转血矛线虫不同时期的转录水平分析提取捻转血矛线虫虫卵和各个时期虫体的RNA,利用荧光定量PCR测定Hccap-15和Hc-cap-17在虫体各个时期的转录水平。两个基因在虫体的各个时期均被转录,其中Hc-cap-15在四期幼虫转录水平最高,Hc-cap-17在二期幼虫转录水平最高。（3）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17在捻转血矛线虫成虫的组织定位通过构建Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的原核表达质粒,表达并纯化了两个重组蛋白。用其免疫新西兰大白兔获得了抗体效价良好的两株多克隆抗体,在此基础上,利用纯化后的多克隆抗体对两个蛋白在捻转血矛线虫成虫中的表达进行了组织定位。其中Hc-CAP-15主要表达于雌性成虫的肠道微绒毛、卵巢、表皮中及雄虫的肠道中;Hc-CAP-17主要表达于雌性成虫的肠道壁及卵巢中。（4）Hc-cap-15和Hc-cap-17的RNAi干扰实验利用浸泡法RNA干扰技术,对Hc-cap-15及Hc-cap-17进行基因沉默,从而探究其在虫体生长发育过程中发挥的具体功能,其中利用特异性siRNA对Hc-cap-15转录水平实现了有效的基因沉默,Hc-cap-15转录水平的下调对虫体由脱鞘三期幼虫到四期幼虫的发育率没有显著影响,但是会导致四期幼虫虫体的体长增长,表明Hccap-15对于虫体的增长具有负调节作用。而不管是dsRNA还是siRNA都无法下调Hc-cap-17的转录水平。（5）Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的反应原性鉴定利用新生小羊的阴性血清及感染捻转血矛线虫山羊的阳性血清对Hc-CAP-15和Hc-CAP-17的免疫原性进行检测,结果表明,重组Hc-CAP-15和Hc-CAP-17蛋白均能够被感染了捻转血矛线虫的血清所识别,证明其具有良好的反应原性。本研究对CAP蛋白家族成员Hc-CAP-15和Hc-CAP-17在捻转血矛线虫时空表达特征及生长发育方面的功能研究,为进一步研究两分子的功能及作用机制奠定了坚实的基础,这对于完善捻转血矛线虫生长发育的分子机制及新型防控措施的开发具有重要意义。
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