肝脏是人体内最大的代谢器官,在维持机体的正常代谢过程中发挥着重要的作用。肝细胞是构成肝脏器官的主要细胞类型,负责执行人体代谢的多项重要功能,肝脏的主要功能包括:产生消化食物用的胆汁,体内糖原的储存,解毒以及血液平衡的调节。有关肝脏的生理和病理条件下的研究也理所应当地成为现代基础医学的生物学主要的研究对象器官之一。器官退化性疾病是一种由构成器官的细胞持续性退化造成的重要疾病,持续的细胞退化和细胞死亡会造成组织或者器官的功能的逐渐缺失以及退化情况会随着时间不断恶化。逐渐萎缩的肝脏功能会造成严重的后果,如果不能够及时纠正,可能会造成个体的最终死亡。因此,可以造成器官退行化的基因和分子调控网络具有非常重大的研究和临床价值,然而这一部分研究,目前并没有得到很好的阐述和解释。同时,更好地发现和了解影响肝脏退化过程的原因及其整个退化过程中所伴随的现象和潜在的分子机制,这对于研究退化性疾病发病机理和研究治愈这类疾病的药物,也是非常重要而且必需的。炎症反应可以由病原微生物或者是宿主产生出来的危险信号分子而激发出来。抗原递呈细胞表达可以感知病原微生物以及由受损细胞发出的内源信号的受体,从而执行炎症反应的响应功能。活化了的这些受体直接开始炎症反应的进行。一些研究报告也表明,炎症反应是大多数慢性肝脏疾病的主要表现形式。炎症复合体是一种可以有效感知微生物病原体以及受损细胞释放出来的危险信号的蛋白复合体,抑制炎症反应中起关键作用的炎症复合体的活性可以有效地治愈慢性肝脏疾病。由肝脏巨噬细胞产生出来的促炎症细胞因子TNF-a,是介导急性或者慢性肝脏炎症反应中最主要的连接者。NF-κB信号途径被广泛报道在肝脏的生理以及病理过程中扮演着重要的角色。正常情况下,失活的NF-κB分子定位于细胞的基质部分,但是一旦NF-κB分子被磷酸化激活,它将转移至细胞核,在那里它通过结合到特异基因的启动子区域,来上调一些细胞因子和趋化因子的转录。TNF-a与NF-κB信号途径之间构成的调控,被证明对于调节影响肝脏代谢平衡的免疫反应有着重要的意义。锌指蛋白是一大类蛋白家族,其中占大多数的是CCHH或者CCCC两种类型,CCCH类型只占所有锌指蛋白的0.8%,但是在哺乳动物基因组中,CCCH却发挥着重要的功能。几种重要的CCCH类型的锌指蛋白据报道,与TNF-a的mRNA的稳定性相关或者是作为一种遍在性存在的连接酶以抑制免疫反应和自我免疫反应。斑马鱼是一种重要的模式动物,具有其他模式动物无法比拟的研究优势。因其在胚胎和遗传上面的优越性,而被广泛用于研究肝脏的发育与再生。在我们的研究里面,我们采用正向遗传诱变筛选的方式,来寻找和鉴定参与调节肝脏发育与再生的基因。我们发现在我们筛选出来的突变体中,一个编号为cq5的突变体,在受精后5天的肝脏发育完全的情况下,随后逐步表现出严重的肝脏退化缺陷。同时,相较于野生型的斑马鱼胚胎发育,cq5突变个体胚胎表现出更加短暂的生命周期。仔细分析突变个体的表型,我们发现ENU筛选得到的cq5突变体胚胎,在4 dpf以前,它们的肝脏,胰腺和肠道这些消化器官的形态和marker的表达与正常的野生型相比较都是正常的,不存在明显的差别,特别是肝脏的发育。使用标记早期内胚层器官marker的sox17启动子驱动的转基因鱼,可以实时观察突变体的胚胎早期内胚层器官是否存在缺陷。通过对比,我们发现cq5的突变体与野生型斑马鱼胚胎在早期内胚层的发育上(12 hpf到4 dpf),sox17标记的肝脏,胰腺和肠道器官早期形态,以及荧光强度并不存在着显著的差异化。这说明,cq5造成的内胚层器官退化,早期并不显现。采用可以特异标记上斑马鱼肝脏(Tg(fabp10a:Dendra2-NTR)),胰腺(Tg(p48:GFP))和肠道细胞(Tg(cdh17:GFP))的转基因鱼系来追踪各自器官的退化过程,我们看到,随着斑马鱼肝脏细胞的逐渐,斑马鱼肠道,胰腺器官也会伴随着相似的逐渐退化的器官退化过程。染色体定位克隆技术可以通过位于不同染色体上的分子标记的多态性,来实现对突变基因染色体和突变区域的有效遗传定位。同时,伴随着斑马鱼全基因组测序的完成,可以通过对突变片段区域内候选基因的蛋白质编码区域测序,实现对候选基因的精准定位。结合这两种技术,我们发现位于斑马鱼13号染色体上的一个名为zc3h8(zinc finger CCCH-type containg 8)的锌指类家族蛋白,可能是引起这一系列突变体肝脏退化表型的基因。Zc3h8蛋白结构域含有三次重复的CCCH类型的锌指结构域,cq5的点突变导致编码第二个锌指结构域的组氨酸(His)突变成为谷氨酰胺(Gln)。采用目前应用非常广泛的基因编辑技术,对突变候选基因进行进一步的验证,我们最终确定zc3h8是引起cq5突变体表型的基因。基因编辑得到的基因敲除纯合子,具有和cq5完全一致的表型特征。Zc3h8基因的原位杂交检测表达模式结果表明,在5 dpf,zc3h8mRNA可以大量表达于斑马鱼的肝细胞中,而在肠道和胰腺中,未见明显的表达。转基因过表达zc3h8基因于野生型胚胎中,可以发现,Zc3h8蛋白定位于细胞的细胞核中表达,这说明,Zc3h8极有可能执行某种转录因子的功能,对特定基因的表达进行转录水平上的调控。细胞增殖和细胞凋亡是影响器官的两个重要的细胞行为和器官维持稳态的重要方面。通过不同时期,对cq5突变体纯合子胚胎进行TUNEL(可以有效标记凋亡细胞)和EdU(可以有效标记增殖细胞)标记,我们发现突变体肝脏细胞相较于野生型胚胎肝脏细胞来说,表现为更加明显的肝细胞凋亡的增加和增殖细胞的减少。通过巨噬细胞标记的转基因鱼系(Tg(mpeg1:eGFP)),可以看到,伴随着器官退化过程,突变体的肝脏和肠道会大量聚集可以执行吞噬作用的巨噬细胞。同时,流式细胞仪分选突变体胚胎退化过程中的肝细胞和细胞转录组测序,结合生物信息学分析我们发现,伴随着突变体肝细胞退化过程,肝细胞特有的标志性基因在肝细胞中出现显著的下调。NF-κB信号相关基因,以及促炎症反应相关因子在整个转录组数据中,表现为明显的上调。RT-PCR(Real-time PCR)和原位杂交表明,这些基因和促炎症因子在突变体肝脏的整个退化过程中,存在着明显的的表达上调。磷酸化的p65抗体可以标记进入细胞核的NF-κB信号分子,通过突变体中磷酸化p65抗体标记,可以明显看到,相较于正常个体,突变体退化过程中磷酸化入核的p65显著强于正常野生型,这说明,突变体中存在高水平的NF-κB经典信号的激活。使用炎症反应抑制剂(Dexamethasone)和NF-κB的抑制剂(JSH-23)分别处理胚胎,可以发现,两种抑制剂处理都可以在一定程度上,减轻突变体造成的肝脏退化表型。有研究报道表明,促炎症反应因子可以诱导NF-κB信号的激活;同时,NF-κB信号的激活,也可以诱导一系列炎症因子的释放和炎症反应的发生。为了区分cq5突变体退化表型中的因果关系,我们进行了一系列相关验证实验,表明,在抑制掉NF-κB信号活性的情况下,高表达于突变体肠道的炎症因子(il1b和mpx)的表达,都会受到了明显的抑制。同时,这种回救效果还表现为对于突变个体中,肝脏凋亡细胞的有效降低。追溯NF-κB信号激活的时间点,我们还发现,NF-κB信号在肝脏出现退化表型之前(4.5 dpf),就已经激活于该区域的肝细胞中。这种情况早于肝脏凋亡细胞大量出现的时间点(5 dpf)。综合已有的实验结果,我们可以看到,zc3h8基因的功能缺失,引起的NF-κB信号通路的活化和一系列的促炎症因子基因的高表达是造成cq5突变体肝脏发育后期表现为器官退化的主要原因。正常生理情况下,斑马鱼中的zc3h8或许在维持肝脏以及其他消化器官(胰腺和肠道)的功能稳态方面具有重要的作用。Zc3h8作为可以入核表达的转录因子,它与NF-κB是否存在直接的相互调控关系?还无法了解。但是它们上下游的这种关系是可以明确的,这样的发现在老鼠和人的实验中发现的CCCH类型锌指蛋白扮演的功能和作用是相匹配的。或许这些对zc3h8基因功能的研究,可以开拓我们对锌指类转录因子影响肝脏稳态和负调节炎症等研究的视野,也为临床研究退行性疾病提供思路和借鉴。