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目的:构建眼发育关键基因PAX6的真核表达载体,初步探究其在真核细胞的表达,进而将PAX6基因转染入小鼠(m)ESCs并获得PAX6/mESCs稳株,为进一步探讨利用PAX6诱导ESCs定向分化为LSCs的可能性奠定基础,以期为角膜损伤提供种子细胞。方法:1.利用基因克隆技术获得PAX6基因并将其定向插入真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,获得重组质粒pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP,脂质体转染法将重组质转染入293FT细胞中,倒置荧光显微镜观察细胞中GFP的表达、蛋白印迹法检测PAX6蛋白表达。2.胰蛋白酶消化法获得MEFs并进行体外扩增培养,绘制各代细胞生长曲线;用抗α微管蛋白加抗生物素蛋白-Cy5、抗鬼笔环肽-FITC、碘化丙啶(PI)分别对细胞的微管、微丝及染色体进行免疫荧光染色,对细胞进行细胞骨架分析;选择第3代MEFs用于制备饲养层,用三个不同浓度丝裂霉素C(10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)分别处理MEFs 1、2、3小时,MTT法筛选最佳处理条件;接种C57BL/6-mESCs于饲养层中进行扩增培养。3.稳定传代后的mESCs按0-800μg/ml8个浓度G418进行筛选获得最佳筛选浓度;Lipofectamine?2000转染试剂进行转染,设立未转染组、空质粒转染组及重组质粒转染组,转染24h后用200μg/ml G418结合GFP荧光进行筛选,100μg/ml G418维持培养,最终获得PAX6稳定表达的细胞株PAX6/mESCs;对转染后的细胞进行PAX6、GFP免疫荧光染色鉴定,Western-blot检测PAX6蛋白在mESCs内表达;AP染色鉴定转染后mESCs细胞干性。结果:1.pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP经PCR和SalI/BamHI双酶切均得到大小为1269bp的条带,测序鉴定该序列与GenBank中PAX6基因序列的同源性达100%,插入基因的大小和方向正确;脂质体转染结果显示,重组质粒转染组293FT细胞内GFP表达,Western blot结果显示PAX6蛋白表达。2.胰酶消化法成功分离昆明小鼠MEFs,生长曲线结果显示P3-5细胞增殖能力较好;细胞骨架免疫荧光染色结果显示第1-3代细胞微管微丝排列整齐,5代以后的细胞微管微丝排列紊乱;10μg/ml丝裂霉素C处理2小时的饲养层细胞利于mESCs细胞的培养;3.200μg/ml G418为mESCs最佳筛选浓度;对转染后的细胞用200μg/ml G418结合GFP荧光进行筛选,获得PAX6稳定表达的细胞株PAX6/mESCs;PAX6/mESCs细胞内有GFP、PAX6荧光表达,Western blot结果显示在PAX6/mESCs中有PAX6蛋白表达,AP染色呈阳性。结论:成功构pEF1α-PAX6-IRES-AcGFP并可在293FT细胞中的表达;成功制备饲养层MEFs用于mESCs培养;成功获得PAX6/mESCs稳株,且PAX6/mESCs在表达PAX6的同时并维持其干细胞的多能性,为进一步研究PAX6诱导mESCs定向分化奠定较好的基础。