【摘 要】
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目的:观察柯诺辛碱B（Corynoxine B,Cory B）对百草枯（Paraquat,PQ）诱导的TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞模型神经保护作用,并进一步研究其对自噬的调节作用及TDP-43聚集的影响。方法:1.建立异常聚集的TDP-43细胞模型。实验分组（1）正常对照组（2）PQ处理组。根据文献,采用1mmol/L PQ诱导SH-SY5Y细胞,建立异常聚集的TDP-43细胞模型;采
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目的:观察柯诺辛碱B（Corynoxine B,Cory B）对百草枯（Paraquat,PQ）诱导的TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞模型神经保护作用,并进一步研究其对自噬的调节作用及TDP-43聚集的影响。方法:1.建立异常聚集的TDP-43细胞模型。实验分组（1）正常对照组（2）PQ处理组。根据文献,采用1mmol/L PQ诱导SH-SY5Y细胞,建立异常聚集的TDP-43细胞模型;采用蛋白质印迹与细胞免疫荧光染色检测TDP-43蛋白聚集。2.观察Cory B对TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞的保护作用。根据文献设定实验分组（1）正常对照组（2）模型组（3）10μM Cory B干预组（4）15μM Cory B干预组（5）20μM Cory B干预组（6）25μM Cory B干预组（7）30μM Cory B干预组。采用CCK8法检测各组SH-SY5Y细胞的存活率。3.观察Cory B对TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞的自噬调节作用。采用免疫荧光染色观察自噬标记物LC3B点状聚集物的形成,并采用蛋白印迹（Western Blot,WB）定量检测自噬标志物LC3（LC3-II/I）的转换情况。4.观察Cory B对PQ诱导的SH-SY5Y细胞TDP-43异常聚集的影响。实验分组（1）正常对照组（2）模型组（3）25μM Cory B干预组。采用蛋白免疫印迹检测TDP-43蛋白的表达情况。结果:1.PQ能诱导SH-SY5Y细胞质内TDP-43（35Kda）异常聚集。细胞免疫荧光染色结果显示,与正常细胞相比,PQ处理的SH-SY5Y细胞的细胞质内点状荧光明显增多,提示TDP-43（35Kda）在细胞质内异常聚集。蛋白免疫印迹结果显示,正常细胞TDP-43（35Kda）表达不明显,而PQ处理组的SH-SY5Y细胞内TDP-43蛋白（35Kda）表达明显增多（t=8.729,P<0.001）。2.Cory B降低了TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞死亡率。我们采用CCK8法检测细胞存活率。与正常对照组相比,模型组的SH-SY5Y细胞的存活率明显降低（t=20.930,P<0.001）。而Cory B能明显提高模型组的SH-SY5Y细胞的存活率（F=142.347,P<0.001）,并且在一定范围内,Cory B对TDP-43异常聚集的SHSY5Y细胞的保护作用具有浓度依赖关系。我们发现25μM的Cory B细胞保护作用最强,因此我们应用25μM Cory B进行下一步实验研究。3.Cory B能促进TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞的自噬过程。LC3免疫荧光染色结果显示,与正常组相比,模型组细胞内绿色点状荧光增加不明显。与模型组相比,Cory B干预组细胞内绿色点状荧光明显增多（t=29.820,P<0.001）,表明Cory B激活了TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞的自噬反应。蛋白质印迹结果显示,与模型组相比,Cory B干预组LC3-II/LC3-I比值明显增加（F=172.913,P<0.001）,进一步证明了Cory B能促进TDP-43异常聚集的SH-SY5Y细胞的自噬过程。4.Cory B能明显减少PQ诱导的SH-SY5Y细胞的TDP-43（35kda）异常聚集。蛋白免疫印迹结果显示,与正常对照组相比,模型组的TDP-43（35kda）表达量明显增高（t=21.670,P<0.001）;而与模型组相比,Cory B干预组细胞TDP-43（35kda）表达量明显下降（t=14.100,P<0.001）。结论:我们的研究发现,柯诺辛碱B（Corynoxine B）具有细胞保护作用,并且能促进百草枯（PQ）诱导的SH-SY5Y细胞自噬进程,而且减少了异常TDP-43蛋白聚集,柯诺辛碱B（Corynoxine B）可能会成为治疗肌萎缩侧索硬化症的潜在药物。
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