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视觉发育是脑研究的一个分支,也是眼科临床基础研究的重要方向。其不仅有助于认识脑的工作原理,更为儿童的眼病治疗和成人视功能损伤后重建提供理论基础。弱视是眼科常见病,弱视患者占世界人口的2-5%,中国有1000多万儿童弱视患者。弱视是在视觉发育可塑性关键期间,由于视觉细胞接受有效刺激不足,造成矫正视力低于正常,而眼科检查未能发现明显器质性病变。弱视患者不仅单眼视力低于正常,更无良好的双眼视功能,於其工作、学习和生活到来诸多困难。目前尚无有效药物。弱视的发生、发展和治疗与视皮层可塑性关键期密切相关,对视皮层可塑性关键期终止机制的研究,将为提高弱视治愈率和开发弱视治疗的药物奠定实验基础。当接近视皮层可塑性关键期终止时,视皮层γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)能抑制性中间神经元细胞外间质(extracellular matrix,ECM)中的硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans,CSPGs)等分子逐渐聚集并形成包绕神经元胞体和树突的神经元周围网络(perineuronal net,PNNs),对轴突生长起阻碍作用。人为降解成年大鼠视皮层PNNs可以成功恢复其视皮层眼优势柱可塑性,并且降低视皮层GABA能神经元对其靶细胞的抑制。以上研究表明GABA能神经元及其抑制性回路的逐渐发育成熟,是导致视皮层可塑性关键期“终止”的重要途径之一,并且PNNs的形成促进了GABA能神经元抑制功能的成熟。组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)作为哺乳动物出生后中枢系统内天然存在的主要的丝氨酸蛋白水解酶,通过形成tPA/纤维蛋白溶解酶(Plasmin)瀑布式级联反应系统,直接或间接地降解多种ECM分子,在介导单眼剥夺所致的视皮层眼优势柱移动的经典可塑性现象中发挥至关重要的作用。但其是否也参与了视皮层发育可塑性关键期的终止?如果tPA参与了视皮层发育可塑性关键期的终止,它作用的细胞内机制又是否与ECM分子有关?目前尚未见文献报道。为此,本课题采用以下技术和方法,在大鼠视觉可塑性关键期及其终止前后,探讨视皮层tPA与视觉发育可塑性关键期终止的关系及其可能的机制。1、应用免疫荧光组织化学、免疫印迹和发色底物法酶活性分析等方法,检测视皮层tPA表达和活性在出生后的发育变化,结果发现:(1)在大鼠出生后1周组视皮层未见tPA表达。(2)tPA在视皮层的表达量在可塑性关键期末期达峰值,到成年期表达最低;其活性随着可塑性关键期高峰、末期、终止一直下降,并且下降趋势逐渐增大,到成年则降至最低水平。(3)在视皮层可塑性关键期高峰、末期、终止及成年阶段,视皮层Ⅱ-Ⅲ层、Ⅳ、Ⅴ-Ⅵ层均可见tPA阳性神经元,且主要分布在Ⅱ-Ⅲ层、Ⅳ层。(4)在发育过程中,视皮层Ⅱ-Ⅲ层的tPA阳性细胞密度在可塑性关键期末期才达到最大值,随后下降,到成年期至最低;分布在IV层的tPA阳性细胞密度在关键期高峰即达到最大值,随即下降,到成年期至最低。2、应用免疫荧光组织化学技术双重标记tPA和PNNs、tPA和GABA能神经元,免疫印迹方法检测GAD65(合成GABA抑制性神经递质的限速酶之一)的发育变化。结果发现:(1)GABA能抑制性神经传递系统和PNNs的发育在结构上同步趋于成熟,均呈持续增加趋势,并在关键期末期有一显著增加过程;而tPA阳性神经元表达在关键期末期达高峰,随后则一直呈现显著下降趋势。(2)从视皮层可塑性末期、终止、到成年的发育阶段,视皮层tPA/PNNs、tPA/GABA双重标记阳性神经元的发育具有相同的显著下降变化趋势,到关键期终止期,这两类神经元均降至成年的低水平;与tPA阳性神经元的发育变化相似。3、应用脑片膜片钳全细胞记录技术结合免疫组化技术,研究外源性调控tPA(外源性给予tPA或其抑制物tPA-stop浸浴作用于视皮层脑片)对可塑性关键期终止前后的大鼠枕叶脑片视皮层IV层PNNs的作用及其对IV层神经元GABAA-IPSCs特性的影响。结果如下:(1)外源性tPA、tPA-stop浸浴对PW 3、PW 5、PW 7各周龄视皮层脑片IV层PNNs的数量无影响,但tPA浸浴对PNNs的形态却发挥了明显的降解作用。(2)外源性调控tPA对不同周龄大鼠视皮层脑片IV层神经元被动膜学特征及PSCs的电学指标无显著影响。(3)tPA浸浴能明显降低视皮层脑片IV层神经元GABAA-IPSCs的复极化时间、反应峰值和IPSCs/PSCs峰值比率,而tPA-stop浸浴对三者则无影响。(4)tPA浸浴使视皮层IV层神经元GABAA-IPSCs复极化时间、GABAA-IPSCs峰值、IPSCs/PSCs峰值比率的发育曲线均发生后移;tPA-stop浸浴则使上述三条发育曲线前移。综上所述,本课题得到以下结论:1、首次揭示了出生后视皮层tPA表达及活性在可塑性关键期终止前后的发育变化,证明tPA参与了视皮层可塑性关键期的“终止”。2、从关键期末期(PW 5)开始,PNNs与GABA能抑制性神经传递系统的发育同步趋于成熟,而tPA阳性神经元表达随发育大幅下调。率先在组织结构水平上揭示:tPA的发育性下调有利于PNNs的形成,从而促进GABA抑制性神经传递系统的发育成熟,介导了可塑性关键期的终止。3、率先发现:外源性给予视皮层脑片tPA浸浴的方式抑制了视皮层IV层GABAA介导的抑制性突触传递功能的发育成熟,进而延长了可塑性关键期;tPA浸浴和tPA-stop浸浴能通过改变视皮层IV层神经元GABA能抑制性突触传递功能的发育特性,参与对可塑性关键期终止的调控。揭示tPA在视皮层的发育性下调有利于PNNs形成并促进GABA抑制性神经环路的发育成熟,从结构和功能两方面起到抑制突触可塑性的作用,可能是tPA参与视觉发育可塑性关键期终止的机制之一。