【摘 要】
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正常植物体的生命过程中,需要各种环境因子都处于非常适宜的状态。如果这些环境因子有一种缺失,可能会影响植物的生长和发育。当各种环境因子处于正常的情况下,植物体才能茁壮生
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正常植物体的生命过程中,需要各种环境因子都处于非常适宜的状态。如果这些环境因子有一种缺失,可能会影响植物的生长和发育。当各种环境因子处于正常的情况下,植物体才能茁壮生长,完成生命周期。但是在自然界中这种非常适宜植物正常生长的环境状态是相当少的。在植物的生长过程中,可能会受到一些外界环境压力的影响。活性氧(Reactive oxide species, ROS)是一系列氧化应激反应中的重要信号分子。在植物体内,活性氧与种子萌发、生长发育、衰老以及光响应有很大关系。当植物受到外界胁迫刺激时,体内会产生大量活性氧。如果过量活性氧不能及时清除,生物体自身的氧化还原平衡将会被打破。目前已经有一些荧光探针可以用来检测生物体内的氧化还原状态。向光素的N端有两个LOV功能域,它们是与光、氧和电压相关的,并且上面都有一个FMN结合位点。光诱导半胱氨酸与FMN的C(4a)结合形成加合物,但是这种加合物在黑暗环境中会被降解。 本研究主要对LOV功能域的C/A(FMN结合蛋白)突变体进行研究,当C/A突变体处于氧化态时,大量失电子,有荧光;当处于还原态时,大量得电子,没有荧光。首先构建FMN结合蛋白(下文中我们将其命名为FBP1.0)大肠杆菌表达载体,通过在大肠杆菌体内对FBP1.0蛋白进行诱导表达,不同浓度H2O2和DTT处理,发现随着H2O2浓度的升高,FBP1.0蛋白荧光逐渐增强;随着DTT浓度的升高,FBP1.0蛋白荧光变弱至消失,说明FBP1.0蛋白对氧化还原比较敏感,会出现氧化还原状态的变化,并且随着光照时间的延长,FBP1.0蛋白荧光逐渐变弱,说明光照得电子大量被还原。又对FBP1.0蛋白进行光谱学分析,发现FBP1.0有表达且会和FMN结合;488 nm光激发,发现在520 nm处有吸收。为了进一步研究FBP1.0的功能,我们又构建FBP1.0转植物超表达载体并转入模式生物拟南芥,获得转基因植株,通过qPCR发现FBP1.0在超表达拟南芥体内有表达,且相对表达量是野生型的3倍。为了筛选一些ROS相关的突变体,进行EMS诱变,进行初筛条件的确定,不同处理条件下观测拟南芥根部荧光情况,结果发现0.5 mM H2O2适宜处理进行突变体筛选,对M2代初步筛选到7棵潜在突变体。
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