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奶牛乳房炎是一种奶牛的多发病和常见病，是由多种致病微生物引起的局部病变，在奶牛养殖业中造成了巨大损失。因此加强对奶牛乳房炎的预防、诊断和治疗显得尤为重要。无乳链球菌sip基因是该菌重要的吸附和定植因子，其核酸序列具有高度的保守性，且广泛存在于无乳链球菌的各个血清型中，具有很强的免疫原性，是B群链球菌重要的候选抗原疫苗。停乳链球菌isp基因编码菌体表面分泌蛋白，具有高度的基因保守性和很强的免疫原性，是停乳链球菌重要的候选抗原疫苗。因此我们根据GenBank报道的无乳链球菌B群链球菌表面免疫蛋白基因(Surface immunogenic protein,Sip)和停乳链球菌免疫分泌蛋白基因（Immunogenic secreted protein, Isp）序列分别设计了两对引物，PCR扩增得到sip和isp基因。sip片段大小为1300bp，isp片段大小为1500bp，其基因序列与GenBank提交序列进行同源性比对，同源性分别为99.46%和98.57%。将sip基因与isp基因分别与表达载体pET-25b和pET-28a连接，成功构建了重组质粒pET-28a-sip和pET-25b-sip。将上述两个重组质粒分别转化BL21，将BL21（pET-28a-sip）、BL21（pET-25b-isp）两阳性重组菌株经IPTG诱导后进行蛋白表达，SDS-PAGE与Western blot检测显示表达的蛋白为目的蛋白，蛋白分子量大小分别为45kD和53kD。对成功构建的菌株BL21（pET-28a-sip）和BL21（pET-25b-isp）表达条件进行优化，在温度是37℃，诱导时间12h和18h，IPTG浓度为0.6mmol/L和1mmol/L时，蛋白表达量最高且得到的融合蛋白具有良好的抗原性，这为进一步研制基因工程亚单位疫苗奠定了基础。通过大量查阅文献，基本确定奶牛乳房炎主要致病菌：无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌中的保守基因，通过Genbank下载大量目的基因片段，建立基因数据库。通过序列比对和同源性比对，筛选出上述致病菌的条码基因，利用焦磷酸测序技术对致病菌的条码基因准确测序，使用特异性引物对大量菌株进行PCR验证和焦磷酸测序验证，最终确定条码基因达到对奶牛乳房炎主要致病菌进行快速鉴定的目的，本研究使用特异性引物对无乳链球菌108株、停乳链球菌100株、203株金黄色葡萄球菌，136株沙门氏菌以及乳房链球菌、嗜热链球菌、表皮葡萄球菌、阪崎肠杆菌ATCC51329、铜绿假单胞菌ATCC15442、肠出型大肠埃希菌O157:H7、产酸克雷伯菌、福氏志贺菌2a型、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、副溶血性弧菌、阴沟肠杆菌、痢疾志贺菌等参照菌各1株进行了检验性扩增，结果显示四对引物有较强的特异性仅出现两例假阳性，且条带大小与目的条带差距不大，未出现假阴性结果。应用PCR-焦磷酸测序方法对18份疑似奶牛乳房炎奶样进行检测，准确率为100％，而使用普通微生物学检验方法的准确率为83％。