柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是取食植物韧皮部汁液的刺吸式口器昆虫。柑橘木虱是柑橘黄龙病病菌Candidatus Liberibacter asiaticus唯一的自然传播媒介。柑橘黄龙病是柑橘毁灭性病害之一,给世界柑橘产业造成了巨大的损失。本文以柑橘木虱为研究对象,利用常规PCR、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)等技术,从分子生态学的角度来研究柑橘-黄龙病病菌-Wolbachia-柑橘木虱互作关系。本研究通过寄主植物生理状态对柑橘木虱生物学特性的影响,系统研究了健康与感病砂糖橘对柑橘木虱适合度的影响;从氨基酸利用的角度分析了黄龙病病菌影响柑橘木虱适合度的营养机制;基于昆虫内共生菌Wolbachia和黄龙病病菌感染与位置分布的相关性,分析了Wolbachia影响柑橘木虱传播黄龙病病菌的分子机制,从而为利用昆虫内共生菌研究柑橘木虱和黄龙病的防控措施提供理论基础。研究结果如下:1.柑橘木虱的形态特征通过对柑橘木虱卵和各龄期若虫形态特征的观察,归纳了各相邻龄期之间的形态差异。柑橘木虱各龄期若虫长宽差距较大:二龄比一龄长0.145 mm,宽0.166 mm;三龄与二龄间差距分别为0.193 mm和0.182 mm;四龄与三龄差距分别为0.351 mm和0.279 mm;五龄与四龄间差距分别为0.572 mm和0.358 mm。在田间一般可先根据虫体大小对各龄期进行初步判定,不确定龄期的再在显微镜下进一步的确认。2.寄主植物对柑橘木虱生活史的影响柑橘木虱卵、一龄若虫以及整个若虫的发育历期受寄主植物的影响较为明显。在柚子寄主植物上若虫存活率最高,在黄皮上最低,且两者差异显著。寄主植物影响柑橘木虱成虫寿命,在柚子上的寿命显著长于黄皮上的寿命。黄皮上的木虱单雌产卵量显著低于其他4种寄主。柑橘木虱在九里香上的内禀增长率最高、酸橘上最低;而净增值率在砂糖橘上最高、黄皮上最低。结果表明在本实验的5中寄主植物中,除黄龙病隐症寄主九里香之外,显症寄主中砂糖橘是柑橘木虱的最适寄主。3.黄龙病病菌对柑橘木虱适合度的影响实验发现,带菌柑橘木虱或者在感病砂糖橘上取食的柑橘木虱世代发育历期均缩短,如卵、若虫以及卵到成虫的整个发育历期,均显著小于健康柑橘木虱在健康砂糖橘上的发育历期。但对于柑橘木虱的存活率来讲其变化趋势正好和发育历期相反,带菌柑橘木虱在感病砂糖橘上的存活率最低,健康柑橘木虱在健康砂糖橘上最高,健康砂糖橘上柑橘木虱的存活率显著高于感病砂糖橘上的存活率。感病砂糖橘上柑橘木虱F1代的单雌平均产卵量显著高于健康砂糖橘。本研究结果表明黄龙病病菌有利于柑橘木虱在砂糖橘寄主上的种群增长。4.黄龙病病菌对寄主植物及柑橘木虱氨基酸组分的影响当砂糖橘感染黄龙病病菌后,韧皮部汁液中各游离氨基酸的组分以及比例均发生了改变。表明黄龙病病菌对柑橘木虱的有利影响可能与砂糖橘寄主韧皮部汁液营养成分改变有关。柑橘木虱取食感病砂糖橘时分泌的蜜露中游离氨基酸天冬酰胺和脯氨酸下降明显,同时这两种氨基酸在感病砂糖橘韧皮部汁液中又明显增加,说明黄龙病病菌增加了柑橘木虱对天冬酰胺和脯氨酸的吸收,这可能利于柑橘木虱若虫发育。同时黄龙病病菌增加了柑橘木虱体内必需氨基酸的含量,必需氨基酸的增加可能有利于柑橘木虱的生长发育。带菌柑橘木虱若虫和健康柑橘木虱若虫在九里香上分泌的蜜露中游离氨基酸的组分差异很小,表明黄龙病病菌对柑橘木虱若虫氨基酸营养吸收的影响不大。5.次生共生菌Wolbachia在柑橘木虱体内分布及感染动态广州柑橘木虱种群体内7种共生菌的感染率存在差异,Carsonella、Profftella和Wolbachia感染率均是100%;Arsenophonus感染率为51.7%;Rickettsia、Cardinium和Hamiltonella三种共生菌的感染率很低。Wolbachia在柑橘木虱卵、各龄期若虫及雌雄成虫体内的感染率存在差异。Wolbachia的含量随着木虱龄期的增加而增多,且雄虫体内Wolbachia的含量高于雌虫。Wolbachia在卵中的分布随着卵的发育而不断变化,从卵柄到卵中部再到远离卵柄一端,最后在老熟卵体内呈现散布型分布。Wolbachia在若虫体内主要集中在含菌体内,而在雌雄成虫体内是局限在虫体腹部。6.黄龙病病菌在柑橘木虱体内分布及感染动态初羽化的柑橘木虱成虫接到感病柑橘树上,分别在15d、30d、45d以及60d收集不同取食时间的柑橘木虱进行检测。结果表明柑橘木虱体内黄龙病病菌含量在取食15d时,黄龙病病菌含量达到最高,此后,随着取食时间的进一步延长而减少。而Wolbachia的含量变化趋势则是随着取食时间的延长而增加。利用常规PCR可以在3-5龄若虫以及成虫体内检测到黄龙病病菌,而q RT-PCR除了3-5龄若虫外,还可以在二龄若虫体内检测到黄龙病病菌,但仍然不能在卵和一龄若虫体内检测到。卵和各龄期若虫中黄龙病病菌的含量是随着龄期的变大而不断增多。对于柑橘木虱的成虫,在产卵盛期的木虱体内黄龙病病菌的含量最高,显著高于产卵前期以及产卵后期。荧光原位杂交技术在柑橘木虱卵、1-3龄若虫体内不能检测到黄龙病病菌,而在四、五龄若虫体内可以检测到黄龙病病菌,病菌主要分布在若虫的U型含菌体内,个别虫体在若虫胸部也有分布。黄龙病病菌在柑橘木虱若虫中的分布位置与Wolbachia在若虫的位置相似,表明了在四、五龄若虫体内黄龙病病菌和Wolbachia可在含菌体内共生。黄龙病病菌在雌雄成虫体内均是散布型分布,且这种分布形式利于黄龙病病菌的水平传播。概括而言,通过砂糖橘-黄龙病病菌-柑橘木虱互作关系研究发现,黄龙病病菌有利于柑橘木虱种群的增长;黄龙病病菌的感染增加了柑橘木虱对氨基酸的吸收与利用;另外,柑橘木虱体内Wolbachia的感染动态与黄龙病病菌的感染动态均是随着龄期的变大而增加,且两者在柑橘木虱若虫体内均分布于含菌体内,二者共生关系可能与柑橘木虱若虫阶段获菌率高有关,推测Wolbachia参与砂糖橘-黄龙病-柑橘木虱三者间的互作来影响柑橘木虱的获菌率,具体分子机制尚不明确,需要进一步研究。