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目的:琥珀酰化修饰是一种由多种酶共同调控、动态可逆的翻译后修饰（post-translational modification,PTM）过程。既往文献报道,琥珀酰化修饰可以参与调控多种恶性肿瘤的发生与发展。目前公认的琥珀酰化酶有四种,包括两种琥珀酰基转移酶——CPT1A和KAT2A,以及两种去琥珀酰化酶——SIRT5和SIRT7。前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸-5-双加氧酶（procollagen-lysine,2-oxoglutarate5-dioxygenase1,PLOD）基因家族是一类Fe2+和酮戊二酸依赖性的赖氨酸羟化酶,包含PLOD1-3三个成员。已知PLOD家族成员能够参与调控包括胃癌（gastric cancer,GC）在内的多种恶性肿瘤的发生与发展。我们的前期分析证实,PLOD2能够作为GC总生存（overall survival,OS）和无病生存（disease-free survival,DFS）的独立预后因素,且其高表达能特异性提示GC腹膜转移的风险;我们原创性地发现GC中PLOD2受琥珀酰化修饰的调控。此外,我们对四种常见的琥珀酰化酶进行泛癌种分析后发现,它们在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,cc RCC）中具有独特的预后预测价值。因此,本研究以琥珀酰化修饰为核心,一方面旨在解析其在GC中调控PLOD2促进腹膜转移的机制;另一方面解析其在cc RCC中的作用和可能机制。方法:1、利用在线数据集分析PLOD1-3在GC组织与癌旁组织的表达,分析其与GC OS及DFS的关系,构建包含PLOD2的nomogram模型,并分析PLOD2表达与GC患者术后出现复发转移,特别是腹膜种植的相关性;2、利用q RT-PCR和Western blotting验证PLOD2在永生化的胃上皮细胞GES-1和不同的GC细胞系中的表达;3、利用Transwell实验、肿瘤细胞-基质胶粘附实验及肿瘤细胞-人腹膜间皮细胞HMr-SV5粘附实验在体外检测（以下统称腹膜转移系列实验）沉默及过表达PLDO2对GC细胞迁移、侵袭、基质胶粘附及对HMr-SV5细胞粘附能力的影响;4.建立裸鼠腹膜转移模型,体内实验验证沉默PLDO2对GC腹膜转移能力的影响;5、利用免疫共沉淀（immunoprecipitation,IP）证实PLOD2受琥珀酰化修饰的调控,并验证添加外源性琥珀酰辅酶A钠盐及琥珀酸二钠盐后PLOD2琥珀酰化水平的变化;6、利用腹膜转移系列实验验证外源性琥珀酰辅酶A钠盐及琥珀酸二钠盐对GC细胞迁移、侵袭、基质胶粘附及HMr-SV5细胞粘附能力的影响;7、利用IP证实CPT1A能与PLOD2结合并上调其琥珀酰化水平;8、沉默CPT1A后,利用q RT-PCR和Western blotting分别检测PLOD2 m RNA水平和蛋白水平的表达变化;9、利用GSE62254和TCGA在线数据库分析CPT1A和PLOD2 m RNA水平的相关性;10、Western blotting证实MG132能够逆转敲减CPT1A并添加Cycloheximide（CHX）对PLOD2蛋白的抑制,证实CPT1A通过泛素-蛋白酶体途径调控PLOD2的表达;11、腹膜转移系列实验证实CPT1A通过调控PLOD2促进GC腹膜转移;12、利用Succinsite和GPSuc网站预测PLDO2的琥珀酰化修饰位点,利用PLMD网站查询PLOD2的泛素化修饰位点,二者取交集寻找PLDO2可能的琥珀酰化-泛素化位点;13、过表达野生型及各位点突变的PLOD2后,利用IP检测PLOD2琥珀酰化修饰水平的变化;14、过表达野生型及341位点K→R的PLDO2后,利用腹膜转移系列实验验证其对GC细胞腹膜转移能力的影响;15、利用TCGA泛癌数据集分析四种琥珀酰化酶在十种常见肿瘤和相应癌旁组织中的表达以及对患者OS的影响,明确其在cc RCC具中独特而重要的预后预测价值;16、利用一致性聚类的方法、根据四种琥珀酰化酶的表达相似性将cc RCC患者分组,分析不同cluster中患者生存情况和临床病理学特征的差异;17、利用“Limma”R包分析不同cluster间的差异基因,利用“clusterprofiler”R包对差异基因进行通路富集;18、利用CIBERSORT网站分析不同cluster间免疫细胞浸润差异;19、利用Imm Port网站提供的免疫基因列表、差异基因分析结果及对差异基因的Cox单因素分析结果取交集、通过LASSO Cox进一步筛选核心免疫基因,构建琥珀酰化酶调控下的免疫基因特征;20、利用Pub Med网站检索文献报道的m6A甲基化酶,利用PLMD在线网站检索这些酶是否存在琥珀酰化修饰位点;21、利用CPTAC中的cc RCC蛋白数据集分析琥珀酰化酶和m6A酶在癌和癌旁中的表达差异及其表达相关性;22、利用免疫组化检测患者标本中四种琥珀酰化酶、LRPPRC以及EIF3B的表达,分析CPT1A与LRPPRC、SIRT5与EIF3B、CPT1A与EIF3B以及SIRT5与LRPPRC的相关性;23、在肾癌细胞系ACHN中敲减CPT1A和SIRT5后,Western blotting分别检测LRPPRC和EIF3B的表达变化。结果:1、PLOD2可作为GC患者OS和DFS的独立预后因素,且其高表达能够特异性提示GC患者出现腹膜种植的风险。在线数据分析提示:PLOD1-3在GC组织中的表达均高于癌旁组织,且PLOD2可作为GC患者OS和DFS的独立预后因素,而PLOD1和PLOD3的表达对GC患者预后无提示意义。我们据此建立了包含PLOD2的、具有良好预测价值的GC nomogram预后预测模型。相关分析结果表明,PLOD2高表达能够特异性提示GC患者术后出现腹膜种植的风险。2、PLOD2在GC中高表达能促进腹膜转移。q RT-PCR和Western blotting的结果显示,PLOD2在GC细胞系中m RNA水平和蛋白水平表达均高于永生化的胃上皮细胞GES-1;腹膜转移系列实验证实:当在MGC803和BGC823中沉默PLOD2时,GC细胞的迁移、侵袭、基质胶粘附和对HMr-SV5的粘附能力均下调;而在BGC823和MKN7中过表达外源性PLOD2则能上调其腹膜转移能力。3、PLOD2琥珀酰化修饰上调促进GC腹膜转移。IP实验证实GC中PLOD2蛋白受琥珀酰化修饰调控;外源性琥珀酰辅酶A钠盐及琥珀酸二钠盐能够上调GC细胞整体的琥珀酰化水平及PLOD2自身的琥珀酰化水平,且细胞迁移、侵袭、基质胶粘附和对HMr-SV5细胞的粘附能力也随之上调。4、CPT1A通过琥珀酰基转移酶活性上调PLOD2促进GC腹膜转移。在MGC803中对PLOD2进行IP后,发现CPT1A能与PLOD2结合;在BGC803中过表达了带FLAG标签的PLOD2和带c-Myc标签的CPT1A,IP FLAG标签后证实其与c-Myc标签结合;在MGC803中沉默CPT1A后,PLOD2的琥珀酰化水平随之下调。5、CPT1A通过泛素-蛋白酶体依赖途径调控PLOD2表达。在MGC803和BGC823细胞中沉默CPT1A后,Western blotting和q RT-PCR证实CPT1A仅在蛋白水平而非m RNA调控PLOD2表达;MG132能够逆转敲减CPT1A联合CHX处理对PLDO2蛋白水平的抑制。6、K341是PLOD2琥珀酰化修饰的关键位点。在线网站预测PLOD2琥珀酰化修饰及泛素化修饰位点并取交集,发现PLOD2共有四个潜在的琥珀酰化-泛素化修饰位点;在BGC823细胞中分别转染带FLAG标签的PLOD2-WT、PLOD2-161R、PLOD2-204R和PLOD2-341R过表达质粒,IP证实过表达PLOD2-341R的细胞中PLOD2的琥珀酰化水平较过表达PLOD2-WT的细胞显著下调;腹膜转移系列实验证实,过表达PLOD2-341R的BGC823和MKN7细胞较过表达PLOD2-WT的细胞迁移、侵袭、基质胶粘附和对HMr-SV5的粘附能力显著上调。7、泛癌分析提示琥珀酰化酶在cc RCC中具有独特的预后预测价值。在十种常见肿瘤——ESCA、STAD、LUSC、LUAD、LIHC、KIRP、KIRC（cc RCC）、COAD、BRCA和BLCA中的泛癌分析结果提示:仅在cc RCC中,四种酶对患者OS均有预后预测价值。8、基于琥珀酰化酶的一致性聚类可将cc RCC患者分为OS和临床病理特征显著不同的三组。根据一致性聚类分析得出的四种琥珀酰化酶的表达相似性将患者分为三个cluster,通过Kaplan Miere生存分析及与临床病理学参数的相关性分析发现:不同cluster间存在显著不同的OS和临床病理学特征。9、琥珀酰化酶可能通过调节免疫细胞浸润促进cc RCC进展,其中Tregs发挥重要作用。不同cluster间的差异基因分析（differently expressed genes,DEGs）及基因本体论（Gene Ontology,GO）通路富集发现,预后较差的cluster中富集到大量免疫相关通路。利用CIBERSORT对患者进行免疫浸润分析发现:Tregs、M0巨噬细胞及静息性肥大细胞在不同cluster中浸润情况有所不同,且Tregs和静息性肥大细胞分别是cc RCC的预后危险因素和保护因素,由此推测在三个cluster中差异浸润最显著的Tregs细胞中在琥珀酰化酶促进cc RCC进展中发挥重要作用。10、基于琥珀酰化酶调控的免疫特征评分能够很好地预测cc RCC预后。我们按照以下原则:（1）在cluster2和cluster1中均上调;（2）可以提示cc RCC不良预后（HR>1,P<0.05）;（3）包含在Imm Port网站所提供的免疫基因列表内,共筛选出34个琥珀酰化酶调控下的差异免疫基因,并通过LASSO降维构建了包含6个免疫基因的风险评分,该评分能较好地评价cc RCC患者的OS预后情况。11、琥珀酰化酶可能通过调节m6A甲基化酶促进cc RCC进展,其中CPT1A和SIRT5分别上调和下调LRPPRC和EIF3B。在cluster2中富集到大量与RNA调控相关的通路,由此推测琥珀酰化酶可能调控RNA调控最常见的形式—m6A甲基化促进cc RCC进展;利用PLMD网站分析了Pub Med中检索到的32种m6A甲基化酶的琥珀酰化修饰位点,发现HNRNPA2B1、HNRNPC、HNRNPG（又称RBMX）、LRPPRC和EIF3B中存在琥珀酰化修饰位点;CPTAC蛋白组数据分析提示,CPT1A与LRPPRC、CPT1A和EIF3B、SIRT5与LRPPRC、SIRT5与EIF3B存在较强相关性（两两间相关系数R的绝对值均>0.5）;免疫组化分析及Western blotting结果提示,CPT1A能够上调LRPPRC,SIRT5能够下调EIF3B。结论:1、PLOD2琥珀酰化水平上调能够促进GC腹膜转移;2、CPT1A能够上调PLOD2的琥珀酰化修饰水平;3、CPT1A通过泛素-蛋白酶体依赖途径调控PLOD2降解;4、PLOD2的关键琥珀酰化修饰位点为K341;5、琥珀酰化酶在cc RCC中具有独特而重要的预后预测价值;6、琥珀酰化酶可能通过调控免疫细胞浸润和免疫基因表达促进cc RCC进展,其中Tregs浸润上调发挥重要作用;7、琥珀酰化酶可能通过调控m6A甲基化酶促进cc RCC进展,其中CPT1A和SIRT5分别上调和下调LRPPRC和EIF3B。