致病性大肠杆菌是引起人和宠物尿道感染的主要病原菌之一，氟喹诺酮类药物，特别是恩诺沙星常用于犬、猫尿道感染的治疗。然而随着氟喹诺酮类药物的广泛应用，耐药性也随之增加。大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药性的发生通常呈逐步演变并常常表现为多药耐药。多药耐药性的流行会危害人和动物健康，再者，由于人类经常与小动物亲密频繁地接触，犬、猫等身上的耐药菌因此可传给人类，又可引起严重的公共卫生问题。为了进一步探讨大肠杆菌对氟喹诺酮类药物产生多药耐药性的机制，本研究分析探讨了不同代的氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性，并系统研究了细菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制，旨在为临床控制大肠杆菌多药耐药性提供理论依据。具体获得以下结果：1.喹诺酮类药物对犬、猫尿道大肠杆菌的体外抗菌活性。体外抗菌活性试验研究了11种喹诺酮类药物（分别代表四代：萘啶酸为第一代；恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星为第二代；奥比沙星和麻保沙星为第三代；加替沙星、普拉多沙星和莫西沙星为第四代）对犬、猫尿道大肠杆菌的体外效能和效力。效能评价指标包括最小抑菌浓度（MIC）和最小防突变浓度（MPC，不包括对喹诺酮类耐药的菌株）。效力评价指标包括相对敏感性，即每个药物的敏感性折点（MICBP-S）与每个药物的MIC的比值（MICBP-S﹕MIC），相对耐药性，即MIC与耐药性折点的比值（MIC﹕MICBP-R）以及突变选择窗（MSW），即MPC与MIC的比值（MPC﹕MIC）。以恩诺沙星作为参照菌，对于恩诺沙星敏感菌，第四代氟喹诺酮类药物和环丙沙星的MIC50和MIC90最小，而萘啶酸、恩诺沙星和奥比沙星的MIC50和MIC90最大（P=0.006）。普拉多沙星的MPC最小（0.29±0.16μg/mL）而氧氟沙星的MPC浓度最大（1.56±0.53μg/mL）（P=0.006）。MSW对于普拉多沙星最小（54.79±30.45）而环丙沙星的最大（152.29±76.04）（P=0.0024）。相对敏感性（MICBP-S﹕MIC）对于普拉多沙星最高（190.1±0.61）而对萘啶酸的敏感性最低（5.33±0.52）（P=0.025）。对于氟喹诺酮类敏感菌，相对耐药性（MIC﹕MICBP-R）可以替代MPC来评估药物的耐药性。此外，本研究98.76%的菌株对于受试喹诺酮类药物具有交叉耐药性。对氟喹诺酮类药物的体外杀菌曲线特点的研究表明，受试的氟喹诺酮类药物均呈现了浓度依赖的特征。2.不同耐药表型大肠杆菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶IV的基因突变及质粒流行情况。以恩诺沙星为参照药物，可以发现，DNA促旋酶和拓扑异构酶IV突变数量能够以渐近的方式与MICs水平联系起来。没有gyrB基因突变被发现。且在NDR或SDR菌株未检测到gyrA、parC和parE基因突变。gyrA基因的单个突变（Ser83Leu）会降低细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性，此后，随着突变数目的增加，大肠杆菌开始出现耐药性，耐药水平从低水平（恩诺沙星MICs4-16μg/ml）到高水平（恩诺沙星MICs≥128μg/ml）。这些发现证实DNA促旋酶的突变是氟喹诺酮类引起犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药菌发生耐药的必要步骤。qnrS和aac(6’)-Ib-cr在泛耐药（PDR）菌株普遍出现（62%），表明这两种质粒介导的耐药基因在多药耐药菌和高水平耐药菌的形成过程中发挥了作用。进化分析研究表明52株细菌中的31株属于系统进化群D群物，15株属于B1群，3株属于B2群，3株属于A群。未发现系统进化群与耐药机制之间的规律性关系。由于受试菌株样本数的数量有限，本次研究未发现ST131克隆株的存在。3.不同耐药表型大肠杆菌的外排泵基因acrB及调节因子的表达大肠杆菌的主要外排泵acrB在不同耐药表型中的表达结果显示，acrB基因在所有受试菌株均有表达，其中在ENRR-MDR菌株中的表达量最大，接下来依次为ENRS-MDR、SDR和NDR菌株。acrB基因在NDR和SDR菌株未出现过量表达，而在20/27株ENRR-MDR菌株以及6/11株ENRS-MDR菌株过量表达。NDR或SDR菌株中的acrB基因表达水平无显著性差异（P＞0.05），而差异在ENRS-MDR菌株开始增加（P=0.073），其表达量在所有的恩诺沙星敏感菌和ENRR-MDR有极显著差异（P<0.001）。此外，acrB基因表达量在高水平、中度、低水平耐药菌和氟喹诺酮类敏感菌之间具有显著性差异（P=0.014）。对于大多数多药耐药菌（MDR），acrB基因的表达随着耐药表型的严重性而增加，换句话说，MDR表型越严重，即耐药的种类越多，则acrB基因表达量会更高。对于marA基因，其在6株ENRR-MDR菌株和3株ENRS-MDR菌株中表达增加，包括两株acrB表达增加和1株SoxS表达量提高的ENRS-MDR菌株。此外，SoxS在3株ENRR-MDR菌过量表达，且与acrB的过量表达相关。膜孔蛋白ompF基因在8株细菌中表达量增加，而在44株中的表达量下降，包括24株ENRR-MDR菌株和20株ENRS-MDR菌株。4.不同氟喹诺酮类药物对外排泵表达的影响qRT-PCR结果显示四种外排泵在ENRS-MDR菌株和ENRR-MDR菌株中均有表达，其中以emrE和acrB的表达相对明显。各外排泵在ENRR-MDR菌株中的表达量高于ENRS-MDR菌株。细菌在氟喹诺酮类药物压力下，四种外排泵的表达量显著升高。在ENRS-MDR菌株，emrE外排泵表达量增加了1.12-5.4倍，acrB外排泵基因表达量提高了1.23-3.60倍，macB基因表达提高了1.40-6.58倍，cmr基因表达量增加了1.52-5.91倍。对于ENRR-MDR菌株，四种相应的外排泵基因表达量分别增加1.22-5.87倍、1.04-2.94倍、1.34-6.29倍和1.47-5.77倍。不同的氟喹诺酮类药物压力对外排泵基因表达的影响也有差异，其中以恩诺沙星最为明显，接下来依次为环丙沙星、奥比沙星、麻保沙星、莫西沙星、加替沙星和普拉多沙星。这种规律基本和这几种氟喹诺酮类药物对大肠杆菌的抗菌活性的强弱相一致。另外，四种外排泵基因在大肠杆菌中的表达也有差异，其中以emrE的表达最为显著，其次为acrB基因表达> macB基因表达> cmr基因表达。我们的研究首次证明，和其它几个受试外排泵相比较，emrE基因的表量增加最多。细菌和低剂量的氟喹诺酮类药物接触会引起外排泵的迅速而明显地升高。表明日常使用氟喹诺酮类药物治疗犬、猫尿道感染应慎重。5.体外诱导宠物源大肠杆菌对普拉多沙星的耐药性及机制采用体外浓度递增法可诱导犬、猫尿道大肠杆菌对普拉多沙星、环丙沙星和麻保沙星产生耐药性，耐药性产生的快慢依次为环丙沙星、麻保沙星和普拉多沙星。和环丙沙星和麻保沙星一样，普拉多沙星诱导的耐药菌首先在gyrA基因发生突变，此后随着MIC的升高，靶基因突变的数目也逐渐在增多。另外，分别有4个由环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药突变株的SoxS发生Ala12Ser突变，而该突变在普拉多沙星诱导的耐药株中未检测到。acrB基因在所有诱导的耐药菌株均有不同程度的过量表达，且在环丙沙星和麻保沙星诱导的耐药株中的表达高于普拉多沙星所诱导的耐药株中的表达。另外，acrB基因的表达随MIC的升高和多药耐药的程度的增加而增加。结论：普拉多沙星所引起的犬、猫尿道大肠杆菌多药耐药性主要由靶基因点突变和外排泵过量表达组合所导致。