蛋白聚糖是一类普遍存在于哺乳动物细胞表面和细胞外基质的大分子。蛋白聚糖一般是由一个或多个糖胺聚糖链共价连接在核心蛋白上组成的。糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)是一类线性的长链碳水化合物,由于硫酸基团和羧基基团的存在因此带有大量的负电荷。天然存在的糖胺聚糖主要分为四类包括硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)/肝素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。其中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖构成主要一类具有重要生物学活性的蛋白聚糖组。肝素是一种细胞内的糖胺聚糖,主要存在于肥大细胞中。肝素与HS具有相似的结构组成都是由糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸,Glucronic acid(GlcA)和 Iduronicacid(IdoA))和葡萄糖胺(Glucosamine,GlcN)通过 1-4 糖苷键形成的二糖单元(-HexAα/β1,4-GlcNα1,4-)组成,在其合成过程中IdoA的2-位或GlcA的2-位以及GlcN的N-位、6-位或3-位会发生不同程度的硫酸化修饰,肝素的硫酸化程度要高于HS。肝素/HS与蛋白配体的结合主要是通过糖链的高负电荷与蛋白的正电荷之间的静电相互作用进行的。通常认为肝素/HS与蛋白配体的相互作用主要依赖于糖链中羧基和硫酸取代基团的数目以及硫酸取代基团在糖链中的分布。自二十世纪三十年代以来,肝素已被成功用作注射用抗凝血药物用于预防和治疗血栓性疾病。肝素与抗凝血酶(Antithrombin,ATⅢ)的相互作用是目前研究最明确的肝素-蛋白配体结合实例。肝素与ATⅢ的结合被称为“锁-钥”结合模式,主要依赖于肝素糖链中含有特殊3-O-硫酸化GlcN的戊糖序列(-GlcNS(orAc)6S-GlcA-GlcNS3S±6S-IdoA2S-GlcNS6S-)。肝素中的特殊戊糖序列与ATⅢ结合,通过改变ATⅢ构象增加其对凝血因子(FactorXa,FXa)和凝血酶(Thrombin,FⅡa)的抑制活性,从而达到抗凝血作用。低分子肝素(Low molecularweightheparins,LMWHs)是由肝素通过不同的降解条件包括酶降解和化学降解制备得到的,具有和母体肝素相同的单糖组成、硫酸和乙酰基团取代形式以及寡糖序列的一类具有较低分子量的抗凝血药物。与肝素相比,LMWHs不具有肝素作为抗凝血药物表现出的药代动力学限制,例如LMWHs具有半衰期长、可预测的抗凝血反应和较低的不良反应效率如肝素诱导的血小板减少症(Heparin-induced thrombocytopenia,HIT)等特点。LMWHs作为碳水化合物类药物与传统的小分子药物和生物大分子药物相比具有独特的结构特征。LMWHs是由具有不同链长、单糖组成、硫酸和乙酰取代形式和序列的寡糖混合物组成。直到2008年全球肝素污染事件发生,肝素和LMWHs结构表征的重要性才受到重视。传统的分析方法包括凝胶渗透色谱分析得到的分子量(Molecularweight,MW)信息以及单糖组成分析和生物活性分析都不足以反映该多糖药物的精细结构并确保其安全性和有效性。2010年美国食品和药物管理局(Food and drug administration,FDA)批准了第一个LMWHs 仿制药依诺肝素钠,为了保证LMWHs仿制药与原研药结构一致性和药物安全性,迫切需要开发LMWHs精细结构的分析方法用来比较原研药和仿制药。LMWHs的异质性可以从以下五个方面进行全面表征:(1)理化性质;(2)高分辨完整糖链分析;(3)寡糖片段分布;(4)二糖和基本组成单元分析和(5)寡糖序列分析。传统的分析方法包括液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、凝胶电泳、毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)和核磁共振波谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)分析不能提供每种寡糖的精细结构信息。质谱技术,特别是与HPLC和CE在线联用的电喷雾质谱(Electrospray ionizsation mass spectrometry,ESI-MS)技术(LC/CE-ESI-MS)已经成为全面表征LMWHs的主要分析工具。类似于蛋白组学分析的两种策略包括“自上而下”和“自下而上”已经广泛用于LMWHs的结构表征。“自上而下”和“自下而上”两种策略应用LC-MS分析LMWHs可以提供LMWHs基本组成信息包括完整糖链分布、寡糖片段分布和基本组成单元,同时每种寡糖得到的结构信息包括糖醛酸(Uronicacid,HexA)和GlcN的数目、寡糖末端结构、硫酸和乙酰基取代数目。HS和肝素的生物活性很大程度上取决于其糖链中特殊的寡糖序列提供的能与多种蛋白配体相互作用的特殊结合位点。这些特殊结构的序列分析对于了解GAG-蛋白相互作用机制是必不可少的。目前研究最明确的肝素-蛋白相互作用的例子是肝素中特殊的戊糖序列与ATⅢ的特异性结合。近些年来,对成纤维生长因子-2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)的研究表明 HS 中 IdoA2S 和 GlcNS是识别FGF-2所必须的,同时FGF-2的激活也需要HS中6-O-硫酸基团的存在。HS/肝素与其他生长因子的结合如FGF-1、FGF-4、肝细胞生长因子和血管细胞生长因子也被证明是依赖于HS/肝素独特的结构特征,进一步证明了 HS/肝素糖链中存在与蛋白相互作用的特殊结合位点。此外,在LMWHs制备过程中,经过化学或酶降解后的肝素,糖链中主要的ATⅢ结合的戊糖序列被保留,而更长的FIIa因子结合区域可能已经被破坏。肝素诱导的副作用,HIT,也证明与肝素糖链中的寡糖序列密切相关。以上两个方面包括GAGs-蛋白配体相互作用机制研究和LMWHs抗凝血药物的安全性和有效性都需要对糖链中特殊的寡糖序列进行序列表征。然而,由于目前缺乏GAGs精确结构的分析方法使得对HS/肝素中与蛋白配体相互作用的确切的结构信息知之甚少。本论文的目标之一就是以低分子肝素达肝素钠作为研究对象,开发分析方法表征达肝素钠中较短寡糖的序列结构,为进一步探究肝素/HS与目标蛋白相互作用的特殊寡糖序列的表征提供研究基础。天然来源分离得到的HS和肝素是高度异质性的混合物,主要由不同链长及不同硫酸取代形式的寡糖组成。从HS和肝素的寡糖混合物中分离得到结构确定的寡糖组分具有很大的挑战性。获得结构确定的HS和肝素寡糖对于研究特定的硫酸化寡糖序列对其生物功能的影响以及开发下一代基于HS的抗凝药物是至关重要的。HS寡糖已经应用纯化学方法进行合成,然而,由于需要使用复杂的基团保护和去保护作用步骤使化学合成具有一定的难度。在化学合成方面的发展已经成功的合成了一种具有抗凝血活性的戊糖磺达肝癸钠(Arixtra),然而由于碳水化合物化学合成存在的困难和挑战,通过化学方法合成平均由40个糖单元组成的肝素是不现实的,因为合成中需要准备大量的前体化合物。因此,HS寡糖的化学合成仅由熟练的合成化学家在少数高度专业化的实验室中完成。在最近几年,化学酶合成方法利用HS生物合成酶包括糖基转移酶、差向异构酶和硫酸转移酶的高度区域选择性合成HS寡糖已经成为高效合成HS寡糖的主要方法。化学酶合成方法模拟HS体内生物合成途径合成具有所需生物活性的多种HS寡糖结构。然而,由于缺乏对HS合成过程中使用的各种硫酸修饰酶底物特异性的了解使得应用化学酶合成具有特定序列的HS寡糖具有一定的难度。本论文的另一个重要目标是研究HS生物合成过程中3-O-硫酸转移酶的底物特异性(3-OSTs),包括3-OST-1和3-OST-3,并对其修饰合成的底物的生物学活性进行研究。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种离线的SAX-ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖序列方法我们将离线的强阴离子交换色谱(Strong anion exchange chromatography,SAX-HPLC)与高分辨率高灵敏度的ESI-MS/MS结合分析复杂的达肝素钠较短寡糖混合物。首先我们通过尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)低分辨分离得到达肝素钠较短寡糖然后再应用SAX进行高分辨分离得到每个较短寡糖组分,最后应用ESI-MS/MS对每个寡糖进行序列测定。应用本实验室开发的快速MS/MS解谱软件对达肝素钠较短寡糖从四糖到八糖的18种代表性组分进行了序列解析。在本研究中通过ESI-MS/MS分析达肝素钠较短寡糖时发现了一种新型的寡糖结构,即含有2,3-0-硫酸化糖醛酸的达肝素钠六糖。同时应用肝素酶完全降解和LC-MS/MS分析进一步验证了该新型结构的存在。本研究方法为LMWHs的结构和肝素降解的反应机制提供了直接和深入的见解,并为进一步表征与蛋白配体相互作用的HS寡糖序列奠定基础。2.研究3-0-硫酸转移酶(3-OST-1和3-OST-3)的底物特异性并应用化学酶法合成新型的3-O-硫酸化修饰的HS寡糖作为HS寡糖中的一种罕见修饰,3-O-硫酸化的HS寡糖的可获得性是非常受限的。在本研究中,我们应用结构确定的化学酶合成的HS寡糖作为底物研究3-OST-1和3-OST-3的底物特异性。我们根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性差异,重新排列酶促反应修饰顺序合成6种新型的3-O-硫酸化的寡糖,包括3种六糖和3种八糖,并对合成的HS寡糖通过HPLC、MS和NMR进行结构验证。该研究中我们还应用合成的3-O-硫酸化的HS寡糖进一步研究了 3-O-硫酸基团对IdoA2S构象的影响,为了解HS与蛋白配体相互作用的分子机制提供基础。本方法根据3-OST-1和3-OST-3的底物特异性的差异设计化学酶合成策略进一步扩大3-O-硫酸基团修饰的HS寡糖库,同时对IdoA2S构象变化(1C4和%o)可以调控HS对潜在结合蛋白的选择性进行了深入研究。3.对3-OST-3修饰合成的HS寡糖进行生物活性研究通过体外和体内生物学实验对3-OST-3修饰合成的寡糖进行生物活性研究。我们应用Lewis大鼠作为研究对象,分别注射阳性对照磺达肝癸钠(FDA批准的具有抗凝血活性的戊糖)、合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖和阴性对照生理盐水,然后在特定的时间点抽取实验大鼠血液进行抗-FXa活性分析。同时我们也对合成的3-O-硫酸修饰的HS寡糖进行体外抗-FXa活性测定。根据生物学活性研究我们发现了一种新型的具有抗凝血活性的3-OST-3修饰合成的八糖,该研究结论与之前报道的3-OST-1修饰的HS寡糖才具有抗凝血活性的结论是矛盾的。同时我们评价用药Lewis大鼠体内寡糖的清除速率,研究结果表明在大鼠模型中,3-OST-3修饰的具有抗凝血活性的HS八糖在体内显示出比磺达肝癸钠更快的清除率,使得该八糖成为可能降低出血风险的潜在的短效抗凝血药物候选物。获得一系列重要的3-O-硫酸化寡糖为研究HS与蛋白配体相互作用机制提供了理论基础,同时为开发新的基于HS的治疗剂提供了可能性。