肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是外周血单核细胞侵润到实体肿瘤组织中演变成的巨噬细胞,可分泌细胞因子、生长因子等物质刺激肿瘤细胞的生长和转移,在肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中发挥重要作用。集落刺激因子-1受体(Colony stimulating factor-1 receptor,CSF1R)是巨噬细胞表面受体,可接收集落刺激因子-1(Colony stimulating factor-1,CSF1),CSF1/CSF1R信号通路可调节巨噬细胞的分化和功能,在正常巨噬细胞转变为肿瘤相关巨噬细胞过程中发挥关键调控作用。目前对CSF1R参与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生分子机制的研究较少,尤其是CSF1R启动子区域的DNA甲基化水平是否与肝癌发生相关尚不明确。本研究以160例HCC患者肿瘤组织和邻近的非癌组织(Adjacent non-cancerous tissues,ANT,简称癌旁组织)为研究对象。使用Illumina公司的Infinium HumanMethylation450 Bead Chip测序芯片,对160对样品进行了全基因组甲基化测序。通过数据分析筛选到大量在肝癌肿瘤组织与癌旁组织中DNA甲基化存在显著差异的基因。本研究以其中一个差异显著的基因CSF1R为研究对象,对其启动子区域的甲基化水平在160对肝癌肿瘤组织与癌旁组织中的差异进行了深入分析。同时在肝癌肿瘤组织及癌旁组织中对CSF1R基因的mRNA及蛋白水平的变化进行了研究。最后对CSF1R基因启动子区域DNA甲基化水平与患者临床病理特征的关系进行了分析。以期获得CSF1R基因启动子区域甲基化对HCC发生的潜在影响,为肝癌临床诊断标记物筛选提供理论依据。具体研究结果如下:1.患者临床病理特征分析。本研究选取160位肝癌患者进行研究,其中男性患者131名,女性患者29名。有饮酒习惯患者55名;同时患有糖尿病患者20名;同时患有高血脂患者37名;136位患者患病与乙型肝炎病毒相关;患有肝硬化的患者占到了总人数的88.8%。具多发性肿瘤者15人;肿瘤直径大于10cm者14人;发生包膜突破者108人;发生肿瘤坏死者29人。2.全基因组甲基化测序。提取160位肝癌患者的肿瘤组织以及癌旁组织的DNA,通过重亚硫酸盐处理,通过Illumina公司的HumanMethylation450 Bead Chip测序芯片进行全基因组甲基化测序。筛选到大量在肿瘤组织以及癌旁组织中DNA甲基化存在显著差异表达的基因,我们选择其中一个差异显著,且在巨噬细胞向肿瘤相关巨噬细胞转化过程中发挥关键作用的基因CSF1R为研究对象进行深入分析。3.肝癌患者癌旁组织中的CSF1R启动子区域甲基化水平显著高于HCC肿瘤组织。通过对CSF1R启动子区域甲基化在160位肝癌患者的癌旁组织与肿瘤组织间甲基化水平进行差异分析,得到肝癌患者的癌旁组织与肿瘤组织在CSF1R启动子区域甲基化上存在显著差异,且癌旁组织中的CSF1R启动子区域甲基化水平显著高于HCC肿瘤组织(65.32 vs.57.26%,P<0.0001)。4.癌旁组织中的CSF1R启动子区域的甲基化位点具有潜在肝癌诊断生物位点意义。通过制作160个样品癌旁组织CSF1R启动子区域甲基化位点的ROC曲线,通过计算线下面积,判断癌旁组织中CSF1R启动子区域的甲基化作为生物标记位点的潜在价值。结果显示所有CSF1R启动子区域的甲基化位点ROC曲线的线下面积均大于0.5,表明肝癌旁组织中CSF1R启动子区域不同CpG位点的甲基化水平具有作为肝癌诊断生物标记物的潜在价值。5.CSF1R在癌旁组织中的mRNA表达水平显著高于肿瘤组织。通过对课题组前期获得的肝癌患者转录组测序数据挖掘发现,CSF1R在癌旁组织中mRNA的表达水平显著高于肿瘤组织。同时通过对TCGA中其他肝癌相关转录组数据的分析,得到了相同的结论。6.CSF1R在癌旁组织中的蛋白表达水平显著高于肿瘤组织。通过取160位患者样本中的16对样本进行组织原位杂交,结果显示CSF1R蛋白主要存在于细胞质中,且在癌旁组织中CSF1R蛋白表达水平显著高于肿瘤组织。7.CSF1R在癌旁组织中的表达与CSF1R启动子区域的甲基化水平呈现出负相关关系。通过对TCGA数据库中其他肝癌患者数据的进一步挖掘,发现CSF1R启动子区域的多个甲基化位点的甲基化水平与CSF1R的表达都呈现出负相关关系。同时分析160位患者CSF1R启动子临近区域的CpG甲基位点,发现其临近位点的甲基化水平与CSF1R的表达也呈现出负相关关系。8.CSF1R基因启动子区域DNA甲基化与肝癌临床病理特征相关性分析。分析160位患者的临床病理特征与癌旁组织中CSF1R基因启动子区域DNA甲基化水平的相关性发现,同时患有糖尿病的肝癌患者的癌旁组织中的CSF1R启动子区域的甲基化水平较低。同时,癌旁组织中CSF1R启动子区域的甲基化水平与常见临床诊断靶标CA199之间呈极显著相关性(P=0.004)。因此癌旁组织中CSF1R启动子区域的甲基化水平具有作为肝癌诊断生物标记位点的意义。此外,癌旁组织中CSF1R启动子区域的低甲基化水平与多发肿瘤、肿瘤大小以及高的肿瘤分期这些临床病理特征之间也存在显著相关性。本研究首次发现肝细胞癌旁组织中CSF1R启动子区域甲基化水平显著高于肿瘤组织,且CSF1R在癌旁组织中的mRNA及蛋白表达水平均显著高于肿瘤组织,CSF1R在癌旁组织中的表达与CSF1R启动子区域的甲基化水平呈现出负相关关系,癌旁组织中的CSF1R启动子区域的甲基化水平具有潜在肝癌诊断标记物价值,本研究为肝癌的临床诊断提供了重要的参考。