研究背景原发免疫性血小板减少症（ITP）是一种临床常见的出血性疾病,目前对难治性ITP的发病机制尚未明确,且无有效的治疗方法。。ITP虽不是血液系统恶性疾病,但对于反复出现血小板重度减低,疗效不佳的患者来说,生存质量极差,而且死亡风险也是极大的。ITP病理生理机制是多方面的,至今仍未完全明晰,目前得到公认的是,绝大多数的ITP的产生都是由体液免疫和细胞免疫共同介导的血小板破坏。ITP的一线治疗药物有糖皮质激素和静脉注射免疫球蛋白（IVIG）,其产生治疗作用的主要机理包括抑制自身抗体的产生,封闭Fc受体的信号传导通路,抑制巨噬细胞的吞噬功能,促进巨核细胞产生血小板等,最终达到提升患者的血小板计数水平。近年不同的研究组均发现,对于抗GPⅡb/Ⅲa抗体介导的ITP,应用糖皮质激素和IVIG的一线治疗效果尚可,但是,若患者体内存在抗GPⅠb-Ⅴ-Ⅸ复合物抗体,治疗上给予上述一线治疗效果往往较差。在目前较为明确的血小板清除的Fc受体依赖途径外,是否存在其他的途径导致血小板的清除呢?最新的体外及体内的实验研究确认了是存在非FcR依赖的血小板清除途径的。血小板膜上的糖蛋白在神经氨酸酶作用下去唾液酸化而暴露乙酰葡糖胺及半乳糖等残基,这些去唾液酸化后的血小板通过表面血管性血友病因子（VWF）受体复合物的聚集,改变了信号传导,并结合到肝脏枯否氏细胞的MAC-1受体或肝细胞的去唾液酸糖蛋白受体（Ashwell-Morell受体）,在肝脏枯否细胞和肝细胞内清除,这不同于以往的血小板在脾脏清除的过程。然而在ITP患者体内血小板的变化如何,是否也存在这种非Fc受体依赖的血小板清除途径,导致一部分ITP患者应用常规的一线治疗效果不佳,目前尚未得到证实。研究目的本课题旨在研究：（1）比较ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化标记物鸡冠刺桐凝集素（ECL）、蓖麻凝集素（RCA-1）的结合水平与正常人的差异,分析ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化的状况；（2）血小板膜表面膜表面糖蛋白去唾液酸化效应与ITP一线治疗疗效关系,间接为血小板清除的非Fc受体依赖途径的存在提供依据,以利于进一步探索有效的治疗方法；（3）研究抗GPIba抗体与ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化相关性；（4）ITP与其他疾病对照组的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平的比较,探讨在不同疾病中,去唾液酸化致血小板减少的发病机制存在的可能性。研究方法1.自2013年3月至2015年1月收集安徽医科大学第二附属医院住院ITP患者作为研究对象,并以伴血小板减少的初诊风湿免疫系统疾病、骨髓增生异常综合征（MDS）、再生障碍性贫血（AA）和急性髓系白血病（AML）患者作为其他疾病对照组,安徽医科大学第二附属医院体检中心20例健康成年人作为正常对照组。2.流式细胞术（FCM）分析我们通过流式细胞仪检测血小板表面ECL及RCA-1标记的情况确定其膜表面糖蛋白去唾液酸化水平,ITP患者、其他疾病对照组及正常对照组的血小板分别与ECL和RCA-1孵育后上机检测,测得ECL及RCA-1结合百分比为去唾液酸化水平。3.改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原法（MAIPA）分析检测ITP患者主要抗体类型,包括抗GPⅡbⅢa及GPⅠba特异性自身抗体,对ITP患者进行分类选择。4.患者治疗方法：61例ITP患者主要接受一线治疗：首先地塞米松,剂量为40mg/d,3～5 d,不联合或联合大剂量静脉丙种球蛋白,剂量为0.4 g·kg·1-d-1,3～5d,后改为口服泼尼松,剂量为1mg·kg-1·d-1,并据疗效逐步减量,维持治疗一个月以上,期间监测血常规,观察疗效。疗效的具体判断标准为：①完全反应（CR）：治疗后血小板数>₁00x109/L且没有出血；②有效（R）：治疗后血小板数≥30×109/L,并且至少比基础血小板数增加两倍,且没有出血；③无效（NR）：治疗后血小板数<30x109/L或者血小板数增加不到基础值的两倍或者有出血。按疗效对患者分成CR、R、NR三组。研究结果1.正常人与ITP患者这两组在性别、年龄上的差异无统计学意义（性别：χ2=2.796,P=0.094；年龄：t=-0.352,P=0.726）,但两组血小板计数的差异有显著的统计学意义,t=21.914,P<0.001,ITP患者的血小板水平是明显减低的。2.正常人及ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平（ECL, RCA-1）的差异有着显著的统计学意义（P<0.001）,ITP患者血小板的膜表面糖蛋白去唾液酸化水平是明显增高的。3.61例ITP患者按疗效分成CR、R、NR三组,运用Kruskal-Wallis秩和检验方法分析,上述三组ECL、RCA-1水平的比较,差异具有显著的统计学意义,P<0.01。血小板去唾液酸化水平与ITP一线治疗疗效的spearman相关系数分析提示二者是相关的,ECL （r=0.391, P=0.002）, RCA-1 （r=0.395, P=0.002）,提示去唾液酸化的指标越高,疗效越差。4.因标本留置问题,本实验中的61例ITP患者中仅29例患者进行了改良MAIPA方法检测,对这29例ITP患者按照抗GPⅠbα抗体阳性组、抗GPⅡb /Ⅲa抗体单阳性组及双抗体阴性组分为3组,运用Kruskal-Wallis秩和检验方法分析,各组ECL及RCA-1的差异无统计学意义,P>0.05。5.其他疾病对照组患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平分析：风湿免疫系统疾病、MDS、AA和AML其他疾病对照组的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平与正常对照组比较均有不同程度的升高（P<0.05）,而AML组的去唾液酸化水平与正常对照组比较无显著差异（P>0.05）。包括ITP在内的五个疾病组之间去唾液酸化水平存在差异（P<0.05）。其中ITP、风湿病及MDS去唾液酸化水平均较高。结论1.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平较正常人明显升高；2.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平与一线治疗疗效相关,随着ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平的提高,患者的一线治疗疗效越差,肝脏内的血小板破坏在ITP的发病机制中占有重要地位,支持了ITP患者血小板清除的非Fc受体依赖途径,利于对患者病情的判断,治疗方案的考虑选择,为应用神经氨酸酶抑制剂治疗ITP的提供了可能性；3.由于进行抗GPⅠbα抗体与ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化相关性分析的病例数较少,各抗体分组的ITP患者去唾液酸化水平无差异,但是在两组去唾液酸化水平的统计图上可以看到存在抗GPⅠbα抗体组的去唾液酸化水平有略高的趋势,由于这组数据较少,抗GPⅠbα抗体与去唾液酸化水平以及最终一线治疗疗效的关系有待后续扩大样本量进行研究。4.风湿病组、MDS组、AA组的血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平与正常对照组比较均有不同程度的升高,而AML组的去唾液酸化水平与正常对照组比较无显著差异。ITP组的去唾液酸化水平与其他疾病对照组中的风湿病组、MDS组及AA组的去唾液酸化水平相当,与AL组比较存在差异,需要考虑风湿病、MDS及AA这三组疾病在血小板减少的发病机制中的相似性,可能都存在去唾液酸化作用导致的血小板破坏清除过程。