研究背景:骨性关节炎是全世界最常见的关节疾病,目前尚无有效的早期干预治疗措施。骨性关节炎会造成关节结构破坏、关节软骨损伤及软骨基质降解,由于软骨细胞和软骨基质都无血管滋养,造成软骨细胞和基质自我修复能力差;炎症环境的刺激会进一步加剧软骨细胞的凋亡和软骨基质的降解。因此,抑制炎症环境中的软骨基质降解、促进软骨细胞再生一直是治疗骨性关节炎的难点。间充质干细胞治疗骨性关节炎已在许多基础研究和临床前期研究中显示出有效性,体现在临床症状的缓解和影像学的改善。间充质干细胞的来源非常丰富,可取自胚胎或成体,如脐带、脐带血、脂肪、骨髓以及滑膜等。间充质干细胞的活力受供体年龄的影响,骨性关节炎是老年性疾病,因此,使用自体间充质干细胞治疗骨性关节炎,效果往往并不理想。由于间充质干细胞的低免疫原性,排异风险小,使用异体间充质干细胞治疗骨性关节炎成为一种选择。然而,使用异体间充质干细胞也面临着相应的问题,潜在的疾病传染可能、伦理学问题,最主要的问题来自于供体提供的细胞数量有限,难以在不长期体外扩增的条件下直接提供足够的治疗所需细胞量。但关于间充质干细胞发挥作用的具体机制目前仍有较多争议。最近的研究表明,间充质干细胞通过旁分泌途径分泌外泌体等生物活性物质作用于受损部位,改善受损部位细胞的基础代谢、完成自身内源性修复,而不是直接定位于受损病灶分化形成受损部位的细胞类型参与直接修复。我们选择诱导多能干细胞作为间充质干细胞的供体,提供了可无限扩增的供体来源。研究了外泌体在间充质干细胞旁分泌体系中发挥的作用,并首次探讨了细胞衰老对外泌体治疗骨性关节炎疗效的影响及其分子机制。实验一诱导多能干细胞源间充质干细胞可通过旁分泌外泌体来改善骨性关节炎目的:研究诱导多能干细胞源间充质干细胞通过旁分泌途径改善骨性关节炎的机制。方法:利用磁珠分选法从诱导多能干细胞中分离出间充质干细胞,并通过流式细胞术及多系分化诱导证实间充质干细胞的纯度和多系分化潜能。建立一个间充质干细胞与炎性软骨细胞共培养的体系,通过免疫荧光、蛋白质免疫印迹以及实时荧光定量聚合酶链式反应等方法检测间充质干细胞通过旁分泌途径对软骨细胞增殖、凋亡、迁移及细胞外基质代谢的影响。通过GW-4869抑制间充质干细胞分泌外泌体,分析外泌体在间充质干细胞旁分泌中的作用。结果:与诱导多能干细胞源间充质干细胞共培养的炎性软骨细胞,增殖比率明显增加、凋亡比率明显减少、迁移能力明显增强、细胞外基质代谢明显改善。以GW-4869处理过的多能干细胞源间充质干细胞与炎性软骨细胞共培养后,软骨细胞的上述表型则无明显变化。通过添加间充质干细胞分泌的外泌体,可以取得直接与间充质干细胞共培养相似的结果。结论:多能干细胞源间充质干细胞可以通过旁分泌途径改善炎性软骨细胞的代谢,而外泌体是这种旁分泌途径中起作用的主要成分。实验二细胞衰老对间充质干细胞外泌体治疗骨性关节炎疗效的影响目的:研究与正常的间充质干细胞相比,衰老的间充质干细胞所分泌的外泌体治疗骨性关节炎的疗效差异。方法:将多能干细胞源间充质干细胞连续传代直至细胞出现衰老征象,以衰老表型相关特异性检测评估衰老细胞增加的比例,并分析出现衰老征象的间充质干细胞在形态、多系分化潜能、外泌体形态、摄取率以及产量的变化。在体内实验中,通过蛋白质免疫印迹以及实时荧光定量聚合酶链式反应等方法对比不同代多能干细胞源间充质干细胞分泌的外泌体对炎症软骨细胞基质代谢的影响。结果:多能干细胞源间充质干细胞在连续传代的过程中出现衰老征象,衰老细胞的比例逐渐增加,失去了典型的纺锤样外观,成脂和成软骨分化潜能明显减弱。与正常的多能干细胞源间充质干细胞相比,衰老的多能干细胞源间充质分泌的外泌体在体内实验中对炎性软骨细胞的基质代谢改善作用明显减弱。结论:衰老的多能干细胞源间充质干细胞所分泌的外泌体对骨性关节炎的疗效明显减弱。实验三功能性miRNA在衰老的间充质干细胞外泌体中减少导致了外泌体疗效的降低目的:研究导致衰老的间充质干细胞外泌体疗效降低的原因。方法:通过miRNA高通量测序对比正常和衰老的间充质干细胞分泌的外泌体内miRNA的变化。将差异表达的miRNA进行生物信息学分析及靶点预测,并通过荧光素酶报告基因实验对预测的靶点进行验证。在体外实验中,通过在软骨细胞内转染miR-130b-3p模拟物及抑制剂进行过表达和抑制,观察细胞外基质相关指标的变化。在体内实验中,在以外泌体进行治疗的大鼠关节内注射miR-130b-3p拮抗剂,通过番红O-固绿染色及免疫组化评价miR-130b-3p拮抗剂对外泌体疗效的影响。通过在衰老的P9代间充质干细胞中过表达miR-130b-3p,增加外泌体内miR-130b-3p的含量,并在体内、体外实验中评估这种外泌体对骨性关节炎治疗作用的变化。在体外实验中,通过在软骨细胞内分别转染miR-105和miR-142-5p的模拟物及抑制剂进行过表达和抑制,观察细胞凋亡及增殖表型的变化。结果:miR-130b-3p,miR-105和miR-142-5p均在衰老的间充质干细胞分泌的外泌体中减少。在软骨细胞中转染miR-130b-3p模拟物可以增强外泌体对炎性软骨细胞基质代谢的改善作用,而转染miR-130b-3p抑制剂则会明显降低外泌体的疗效。在大鼠关节内注射miR-130b-3p拮抗剂会逆转外泌体对大鼠软骨退变的治疗作用。外泌体内的miR-130b-3p可以直接作用于TCF4的3’非翻译区,从而抑制NF-k B通路。在衰老的P9代间充质干细胞中过表达miR-130b-3p,可在体内、体外实验中恢复外泌体对细胞外基质的保护作用。miR-105可直接作用于RAP2C,miR-142-5p可以通过调节Notch信号通路,二者均可抑制软骨细胞的凋亡,促进增殖。结论:外泌体内的miR-130b-3p可有效改善软骨细胞基质代谢。miR-105和miR-142-5p可以促进软骨细胞增殖,抑制凋亡。衰老的间充质干细胞分泌的外泌体内这些重要功能性miRNA的减少,可能是导致其疗效降低的原因。在衰老的间充质干细胞中过表达miR-130b-3p可恢复外泌体对骨性关节炎的治疗作用。