论文部分内容阅读
背景和目的肺癌严重危害人类的健康,是肿瘤死亡的主要原因,其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)占80%。放射治疗是非小细胞肺癌重要的治疗手段,约64.3%的患者在其治疗的不同时期需要接受放疗。肿瘤放射治疗过程中能产生一系列的生物学效应,从而杀灭肿瘤细胞,其中最主要的是DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)。然而,肿瘤细胞内存在DNA修复机制(包括非同源末端连接及同源重组修复),这是影响放射敏感性的一个重要因素。在许多肿瘤包括NSCLC中,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号或活性异常是肿瘤发生发展过程中的关键因素,已成为重要的治疗靶点。临床研究表明EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)在晚期NSCLC中取得显著疗效,尤对EGFR酪氨酸激酶区域突变患者更敏感。在NSCLC中EGFR高表达,是放疗抵抗主要影响因素,应用EGFR抑制剂能增加放射敏感性。研究表明EGFR酪氨酸激酶区域突变的NSCLC细胞株对放射线更敏感。但是EGFR酪氨酸激酶区域突变是否能影响DSBs修复,从而增加放射敏感性的研究尚未见报道。本研究通过对EGFR不同突变的细胞株进行研究,探讨EGFR突变对放射线诱导的DNA DSBs修复的影响及其潜在分子机制。方法本研究选取野生型EGFR细胞株A549(wt EGFR)和突变型EGFR细胞株H1975(21外显子L858R EGFR),分别进行不同剂量的6MV-X射线照射后,用克隆细胞计数的方法计算细胞生存分数(SF)、拟合细胞存活曲线,观察放射敏感性。并通过免疫荧光技术观察YH2AX焦点数及Rad51焦点数的变化,推测DNA双链断裂后修复动力学及同源重组修复变化,用Western blot法检测放射线诱导的DNA双链断裂修复蛋白DNA-PKcs和Rad51的表达及免疫共沉淀法检测EGFR与DNA-PKcs的结合。结果1. EGFR突变对克隆细胞生存的影响两种肺腺癌细胞株用6MV-X线照射后进行克隆细胞形成实验,结果显示H1975细胞在各个剂量点的细胞存活率均低于A549细胞株,H1975和A549细胞株SF2分别为为0.62、0.89,α/β值分别为4.00、0.19。证实H1975细胞株对放射线更敏感,且细胞修复能力较弱。2. EGFR突变对放射线诱导的DNA修复的影响两种肺腺癌细胞株进行免疫荧光实验,结果显示H1975细胞株经X线照射后各时间点细胞核内γH2AX焦点数多于A549细胞株,且持续时间更长。H1975细胞株γH2AX焦点数照射后3h保持有70%,并在照射24h仍保持有25%的焦点数。而在A549细胞株中γH2AX焦点数照射后3h已消失近80%。这一结果说明H1975细胞株能延缓经X线诱导的DNA损伤修复动力学。3. EGFR突变对DNA修复影响的潜在分子机制两种肺腺癌细胞株进行免疫共沉淀及western blot等实验,结果显示A549细胞株经X线照射后EGFR进行核转运与细胞核中DNA-PKcs结合,并于照射4Gy后60min时两者结合达到高峰,后逐渐下降,并于24h时回归到基础水平。在照射8Gy后rad51蛋白在细胞核中表达逐渐增加,并在照射后6h时到达高峰,后逐渐减少,发挥同源修复作用。H1975细胞株经X线照射后EGFR不发生核转运,不形成EGFR-DNA-PKcs复合物,且不能影响放射线照射后细胞核中Rad51蛋白的表达,说明EGFR突变的肺腺癌细胞株不能参与非同源末端连接及同源重组修复,从而延缓DNA修复动力学,这可能是EGFR突变细胞株对放射线更敏感的机制之一。结论EGFR酪氨酸激酶区发生突变的肺腺癌细胞株,对X射线更敏感,能通过减少X线照射后DNA DSBs的修复,包括非同源末端连接和同源重组修复,从而延缓DNA修复动力学。