研究背景目前全世界每年约有二十万以上的女性患有卵巢癌疾病。与其他身体器官相比较,卵巢的癌症发病率尽管比较低,但是其病死率却很高。据英国的疾病统计分析获悉,卵巢癌病死率已经位列第五位。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)是最常见的卵巢部位发生的肿瘤,占所有卵巢部位恶性肿瘤大约85%-90%。虽然近些年,手术治疗以及铂类为主的联合化疗,同时辅以新放疗技术的提高以及与分子靶向等生物治疗相结合可一定程度改善患者的的生存及预后,但是EOC的治疗效果却一直没有得到显著的改善,同时由于晚期复发率比较高,致使EOC的5年生存率一直处于妇科恶性肿瘤的末位。EOC的病死率高主要的原因之一是早期诊断相对比较困难,诊断明确的大多已处于晚期,而这些患者5年生存率不到30%。患者早期症状不明显,另外卵巢体积相对较小附着于子宫两侧,这些都加大的早期筛查和诊断EOC的难度。同时其早期症状腹部隐痛、轻微坠胀感等不适又非常容易和胃肠疾病相混淆,所以EOC常被称为“沉默杀手”。早期有效的筛查早期治疗对EOC尤为重要。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的异常激活是肿瘤发生发展的非常重要因素之一,其与动物胚胎发育和肿瘤细胞生物学特性密切相关,特征是上皮细胞失去极性和接触抑制而获得问质表型,进而参与调控EOC的增殖、逃逸、转移及间质血管生成。E盒锌指结合蛋白2(zinc finger E-box bindinghomeobox 2,ZEB2)作为EMT的核心因子,其与E-cadherin基因启动子的E盒结合,抑制E-cadherin的表达,诱导细胞发生EMT,通过介导肿瘤细胞的黏附性、细胞极性、细胞凋亡,调控原癌基因和维持微环境等过程,从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。ZEB2在许多恶性肿瘤组织中能够增强肿瘤细胞的侵袭和转移,如宫颈癌、甲状腺癌、乳腺癌等,ZEB2的过度表达极有可能增强EOC的侵袭和转移,但是到目前为止ZEB2在EOC组织中的表达情况报道却较少。原癌基因C-myc(cellular avian myelocytoma virus,C-myc)编码的蛋白为62KD的磷酸化蛋白,位于细胞核内,具有DNA结合能力,其表达可促进DNA复制,调节细胞周期、细胞增殖及分化等功能,C-myc编码的蛋白过度表达极有可能促进EOC的恶变、进展等过程。目的本研究的目的是应用免疫组织化学二步法技术通过研究正常卵巢组织、上皮性卵巢癌组织中的E盒锌指结合蛋白2(ZEB2)及原癌基因C-myc (C-myc)的表达水平,分析ZEB2及C-myc在各组织中的表达及相关性,分析两者之间的关系,并探讨它们与EOC侵袭、转移以及临床病理特征之间的关系。方法1. 标本的收集选取2008年9月至2015年1月南方医科大学第三附属医院病理科存档石蜡包埋卵巢组织标本及西安爱丽娜生物技术公司提供卵巢组织标本共204例,其中EOC组织191例(粘液性腺癌32例,浆液性腺癌159例),正常卵巢组织13例、均经病理学证实。191例EOC患者根据国际FIGO临床分期标准：Ⅰ期137例,Ⅱ期28例,Ⅲ期17例,Ⅳ期9例；无淋巴结转移173例,有淋巴结转移18例;无远处转移182例,有远处转移9例；T分期中T1期139例,T2期32例,T3期20例。年龄在22-81岁之间,其中≥47岁182例,<47岁9例。EOC所有患者术前均未行放疗、化疗、生物治疗。对照组13例正常卵巢组织为同期因非卵巢疾病接受手术治疗获得的正常卵巢标本。2.免疫组化获取的正常卵巢组织13例、EOC组织191例组织的石蜡标本,连续切片。石蜡切片二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脱蜡30分钟,梯度酒精脱水(100%,90%,80%,70%),用PH7.4的PBS溶液冲洗后,滴加PH=6.0柠檬酸盐缓冲液,将切片完全浸入柠檬酸缓冲液中,加热沸腾后进行抗原修复。加入一抗(小鼠抗人ZEB2单克隆抗体和小鼠抗人C-myc单克隆抗体均购自美国Abcam公司)小鼠抗人ZEB2单克隆抗体和小鼠抗人C-myc单克隆抗体,室温孵育60min; PBS冲洗后加入二抗(上海吉凯基因科技有限公司)室温孵育60min。PBS冲洗3次×3min,DAB显色,室温孵育3-5min,光镜下控制显色,显色30秒后蒸馏水冲洗终止显色,苏木精复染1分钟,1%酒精分化,蒸馏水冲洗返蓝5分钟,切片浸入梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脱水各2分钟,二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明后用中性树胶封片,显微镜下观察染色效果。3.免疫组化结果判断结果判定采用双盲法,同时由2位资深病理科医师独立观察每张切片后进行判定。判定标准采用半定量评分法,在显微镜下每张切片随机选择5个高倍镜视野,计算100个细胞／视野,根据染色强度和阳性细胞百分比进行判定。阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分,1%～为1分,10%～为2分,50%～为3分,75%-为4分；染色强度：无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。2项评分乘积>4分为阳性,≤4为阴性。4.统计分析实验数据采用SPSS 20.0统计学软件对所有数据进行统计学分析。ZEB2和C-myc在正常卵巢组织及EOC组织的表达、各临床病理因素之间的相关性及相关关系均采用X2和Spearman等级相关检验,P<0.05(双侧检验)为差异有统计学意义。结果1.ZEB2蛋白主要分布于细胞的胞质,偶尔也可出现细胞核的表达,呈淡黄色至棕褐色颗粒,正常卵巢组织有较低的表达率。而C-myc蛋白主要定位于细胞核,也可出现细胞质的表达,呈棕褐色颗粒,在正常组织的表达率较低。2.ZEB2的表达(1)ZEB2在EOC组织的阳性表达率(49.2%94/191)高于正常卵巢组织(7.7%1/13),差异有统计学意义(P=0.004)。(2)ZEB2表达与EOC的病理分型相关,在黏液性腺癌的阳性表达率(70.0% 24/32)高于浆液性腺癌(44.0%70/159),差异具有统计学意义(P=0.001)。(3)ZEB2的表达与FIGO分期、T分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关系,在Ⅲ～Ⅳ期中阳性表达率(69.2% 18/26)高于Ⅰ～Ⅱ期(46.1%76/165),差异具有统计学意义(P=0.028)；在肿瘤T分期中阳性表达率T3>T2>T1(80%16/20 VS 62.5% 20/32 VS 41.7% 58/139,P=0.002),差异具有统计学意义,同时与肿瘤分化程度亦有统计学差异(P=0.022)；有淋巴结转移者阳性表达率(72.2% 13/18)高于无淋巴结转移者(46.8% 81/173),差异具有统计学意义(P=0.04)。(4)ZEB2的表达在EOC组织中,与患者的年龄(P=0.536)及远处转移(P=0.326)等未见明显统计学意义。3.C-myc的表达(1)C-myc在EOC组织的阳性表达率(53.9% 103/191)高于正常卵巢组织(15.4%2/13),差异有统计学意义(P=0.007)。(2)C-myc表达与EOC的分化程度相关,在低分化组腺癌组织的阳性表达率(59.7%74/124)高于高分化组腺癌组织(43.3%29/67),差异具有统计学意义(P=0.03)。(3)C-myc的表达与FIGO分期、T分期有关系,在Ⅲ～Ⅳ期中阳性表达率(73.1%19/26)高于Ⅰ～Ⅱ期(51.0% 84/165),差异具有统计学意义(P=0.035)；在肿瘤T分期中阳性表达率T3>T2>T1(80%16/20 VS 62.5%20/32 VS 48.2% 67/139,P=0.016),差异具有统计学意义。(4) C-myc的表达在EOC组织中,与患者的年龄(P=0.268)、病理分型(P=0.38)、淋巴结转移(P=0.102)、远处转移(P=0.182)等未见明显统计学意义。4.ZEB2和C-myc的关系(1)ZEB2和C-myc在EOC组织中的表达经过Spearman相关性分析,两者具有直线相关性,且呈正相关性(相关系数R=0.358,P<0.001)。(2)ZEB2及C-myc的共同表达与T分期和FIGO分期分别具有直线相关性(P<0.001：P=0.008)。结论1.ZEB2主要分布于肿瘤细胞的胞质,呈淡黄色至棕褐色颗粒,在EOC组织中具有较高的表达率,而且随着肿瘤FIGO分期、肿瘤T分级的升高,ZEB2的阳性表达率也随之增高；EOC组织中有淋巴结转移者的ZEB2阳性表达率远高于无淋巴转移者,提示ZEB2表达对EOC的淋巴结转移起着促进的作用。结合以上结果提示,ZEB2作为转录因子,其较高的表达率与TNM分期、淋巴转移确切有关,ZEB2的阳性表达率随着TNM分期而越高,淋巴结转移的可能性也越高。ZEB2作为促癌基因在肿瘤转移中发挥重要作用,它可能成为评价EOC发展、转移的一个有价值的指标。2. C-myc蛋白主要定位于细胞核,呈棕褐色颗粒,在EOC组织中具有较高的表达率,而且与肿瘤FIGO分期、肿瘤T分期、肿瘤分化程度有关。随着肿瘤FIGO分期升高、T分期越高、肿瘤分化程度越低,C-myc的阳性表达率越高,但与年龄、淋巴结转移、病理分型、远处转移等不相关。由此可以看出C-myc的高表达与TNM分期、T分期、肿瘤分化程度确切有关,C-myc表达越高肿瘤分化程度越低,TNM分期越高,同样有望成为评价EOC分期及T分级的一个有价值的指标。3.ZEB2和C-myc在EOC发病机制中可能存在相关性,并且在肿瘤FIGO分期及T分期中具有明显的相关性,以此为基础,进一步探讨EOC的发病机制及筛查指标,联合检测有望成为评价EOC发生进展等一个有价值的指标。