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目的 探究Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信号转导与转录调节激酶3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路对大鼠胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSC)激活的影响,为氧化苦参碱(oxymatrine,OM)抗慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)胰腺纤维化提供理论依据。方法 本实验分以下两部分:细胞实验研究JAK2/STAT3信号通路是否参与转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活PSC;动物实验检测OM抗胰腺纤维化中对胰腺组织内JAK2/STAT3信号通路影响。在细胞实验部分,使用不同浓度梯度(0、4、8、12、16和20 ng/ml)和时间梯度(6、12、18和24h)的TGF-β1刺激永生化大鼠胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells,PSC)LTC-14细胞,应用MTT检测法获得LTC-14细胞活性最高时的最适浓度和最适时间。随后在TGF-β1最适浓度和时间刺激下,利用Western Blot和Realtime PCR检测LTC-14细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和JAK2/STAT3信号通路分子表达。通过给予LTC-14细胞JAK2特异性拮抗剂AG490,观察JAK2通路阻断后对该细胞激活的影响,并利用ELISA检测JAK2对TGF-β1诱导LTC-14细胞分泌IL-6和IL-1β的影响。制备STAT3不同位点的干扰质粒,通过Western Blot和Realtime PCR获得STAT3干扰RNA的有效位点。再通过转染有效的STAT3干扰质粒,检测STAT3表达抑制对LTC-14细胞激活的影响。在动物实验部分,雄性Wistar大鼠(体重250-300 g)32只,按体重编号后,随机将大鼠分为正常对照组(NC组)、模型组(CP组)、OM预防组(OP组)和OM阴性对照组(OM组),每组8只。CP组和OP组大鼠按照500mg/kg/2d的量腹腔注射二乙基二硫代氨基甲酸钠(Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate,DDC)来建立大鼠CP胰腺纤维化模型,NC组和OM组注射等体积的生理盐水。在注射DDC前2 h,OP组按照100 mg/kg/d的量腹腔注射OM对大鼠进行治疗,OM组注射等体积OM做阴性对照,其余两组注射等体积的生理盐水。注射实验进行4周,利用Masson染色检测胰腺组织纤维化程度;Realtime PCR检测胰腺组织中JAK2、STAT3和SOCS3的表达。所有实验进行三次独立重复,使用Graphpad Prism 6.0统计软件进行数据分析,两组样本采用t检验,多组样本采用单因素方差分析,P﹤0.05具有统计学意义。结果 在细胞实验部分,MTT法检测结果显示TGF-β1刺激最适浓度为8 ng/ml,最适时间为12 h。使用8 ng/ml TGF-β1刺激LTC-14细胞12h后,我们发现TGF-β1刺激组细胞内JAK2、STAT3、SOCS3、p-STAT3和α-SMA蛋白表达均较对照组明显升高(P﹤0.05);Realtime-PCR结果显示TGF-β1刺激组细胞内诱导的JAK2、STAT3、SOCS3和α-SMA分子的转录水平明显高于对照组(P﹤0.05)。给予LTC-14细胞AG490,可明显抑制TGF-β1诱导的STAT3的激活以及SOCS3、α-SMA的m RNA与蛋白生成(P﹤0.05)。ELISA检测结果显示TGF-β1可明显诱导LTC-14细胞外IL-6和IL-1β的分泌(P﹤0.05),而使用AG490能够明显抑制TGF-β1诱导细胞外IL-6和IL-1β的分泌(P﹤0.05)。针对STAT3多个位点设计干扰RNA,发现STAT3基因1345位点干扰RNA可成功抑制STAT3蛋白和m RNA的生成(P﹤0.05)。使用该STAT3干扰RNA能够明显减少LTC-14细胞中TGF-β1诱导的STAT3、SOCS3和α-SMA蛋白与m RNA的生成(P﹤0.05),并且减少STAT3的激活(P﹤0.05)。在动物实验部分,Masson染色见CP组胰腺纤维化程度明显高于NC组(P﹤0.05);与CP相比,OP组胶原纤维面积百分比明显减少(P﹤0.05);而OP组、NC组和OM组之间无明显差异(P﹥0.05)。Realtime PCR结果显示CP组大鼠胰腺组织中JAK2,STAT3和SOCS3 m RNA表达量明显均高于NC组和OM组(P﹤0.05);与CP组相比,OP组注射OM后JAK2,STAT3和SOCS3 m RNA表达水平明显下调(P﹤0.05),而OP组、NC组和OM组之间均无统计学差异(P﹥0.05)。结论 1 TGF-β1可通过促进JAK2/STAT3信号通路分子的表达和活化来激活PSC。2 OM可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路来抑制胰腺组织纤维化发生。