研究背景和目的： 新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是围生期窒息引起的新生儿脑损伤，是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。HIE的发病机制至今仍未完全阐明，认为主要与兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙离子超载及细胞凋亡等原因有关。目前治疗HIE所采用的兴奋性氨基酸受体拮抗剂、多种脑细胞活性药物，以及功能锻炼效果均不满意，不能使坏死的神经细胞再生。因此有必要寻找一种切实有效的修复损伤脑组织的治疗方法。 间充质干细胞(MSCs)是一种来源于中胚层的多潜能干细胞，具有自我更新、高度增值，以及多向分化的特性。近年来研究表明，MSCs在体外合适条件下，可定向分化为神经样细胞，并具有在体内向脑损伤部位迁移的能力，使得移植MSCs治疗中枢神经系统损伤成为可能。目前已有MSCs移植治疗成年动物神经系统疾病取得一定疗效的报道，但对于新生儿和未成熟动物HIE的研究较少。 MSCs移植治疗HIE的机制尚不清楚。MSCs虽在体外可定向分化为神经样细胞，但研究表明，其移植入脑后只有极少部分分化为神经样细胞，能否真正与自体的神经细胞形成化学突触未有报道。另一方面，MSCs可以分泌多种细胞因子，如GDNF、bFGF、IL—6等，这些细胞因子在神经系统发育及分化过程中发挥重要的作用。体内外实验均证实，GDNF、bFGF、IL—6等参与并促进了神经系统损伤的修复和再生。因此有理由推测，对神经系统损伤后的功能改善而言，细胞因子分泌的变化，比移植细胞的神经替代功能更为重要。 本实验拟研究MSCs移植入新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型后，不同时段大鼠脑组织内GDNF、bFGF、IL—6含量的变化，初步探讨MSCs移植治疗新生大鼠HIE的机制，为进一步进行MSCs移植治疗新生儿HIE的临床应用提供实验依据。 实验方法： 一、骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养和纯化 1、MSCs的分离培养、纯化 无菌条件下取4～6周龄健康的SD大鼠的双侧股骨、胫骨，剪断股骨、胫骨两端，用L—DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓于离心管中，用吸管吹打成单细胞悬液，以1000r/min离心10min，弃上清，再用PBS液洗涤一遍，用含10％胎牛血清的L—DMEM完全培养基重悬细胞，将其接种于25c㎡培养瓶中，置于37℃5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中原代培养，倒置相差显微镜下每日观察1次，3天后半量换液，去除未贴壁细胞及杂质细胞，5天后全量换液，以后每3天换液1次，待贴壁细胞生长接近90％融合时，用PBS冲洗2次培养瓶以去除含血清培养基。以适量0.25％胰蛋白酶—0.02％EDTA室温消化，将细胞悬液按1：2的比例传代接种。待传代细胞生长接近完全融合时，可继续传代。 2、MSCs的鉴定 MSCs培养至第5代时，以适量0.25％胰蛋白酶—0.02％EDTA室温消化，PBS洗2次后制成单细胞悬液，送流式细胞仪室检测CD34、CD45、CD29、CD44、CD105。 二、新生鼠HIE动物模型的建立和MSCs移植治疗HIE 1、新生鼠HIE动物模型的建立 将7日龄新生SD大鼠随机分为正常对照组(n=20)、HIE手术组(n=20)、PBS对照组(n=20)、MSCs移植组(n=20)。 除正常对照组外，其余3组乳鼠用无水乙醚吸入麻醉后，仰卧固定于手术木板上，75％酒精消毒皮肤，切开颈部正中皮肤，分离出左颈总动脉，用5-0丝线结扎两端并剪断血管，缝合皮肤。术后2小时，放入37℃水浴密闭透明塑料箱中，通入8％O2及92％ N2的混合气体，维持2.5h后，送回原环境中母鼠喂养。正常对照组放入同样密闭箱中2.5h，通正常空气。 2、MSCs移植治疗HIE MSCs移植组建立HIE模型后24h，将第5代MSCs(1×106个活细胞，100g/ml)经尾静脉移植入乳鼠。PBS对照组则在相同时间，将PBS(100g/ml)经尾静脉注入乳鼠。HIE手术组和正常对照组均不作处理。 三、大鼠神经功能损害测评及脑组织内GDNF、bFGF、IL—6含量的检测 1、大鼠神经功能测评 采用大鼠改良神经功能损害评分(mNSS)，评估各组HIE大鼠在移植后1d、3d、7d、14d的神经功能损害情况，正常对照组在相应日龄完成该评分。 2、新生鼠HIE模型的鉴定及脑组织匀浆制备 MSCs移植组和PBS对照组分别在移植后1d、3d、7d、14d，HIE手术组和正常对照组则在相应日龄，完成大鼠改良神经功能损害评分后，快速处死，取出脑组织，取视交叉后2mm附近的冠状面脑组织块，以10％福尔马林固定，制成病理切片，HE染色。 剩余脑组织制备匀浆，以2000r/min离心10min，收集上清液，—20℃冰箱保存待测。 3、脑组织内GDNF、bFGF、IL—6含量的检测 采用GDNF、bFGF、IL—6的ELISA试剂盒，按说明书逐步操作，最后在酶标仪450nm处读出A值，依照标准含量与A值，建立一元回归方程及标准直线，取在标准直线范围内的检测值。 结果： 一、MSCs的体外分离培养和纯化 1、MSCs的原代培养和传代 正常SD大鼠骨髓分离出单个核细胞，接种于培养瓶3天后，可见少量细胞贴壁，7天可见较多细胞贴壁，部分克隆性增生，在原代培养约15天左右，细胞可达90％以上融合。传代后细胞生长增快，3～4天可继续传代，细胞呈漩涡状、辐射状或鱼群样排列。MSCs传至第5代左右，杂质细胞已基本消失。 2、MSCs的鉴定 流式细胞仪检测结果示，第5代MSCs的CD34、CD45阴性，CD29、CD44、CD105阳性。 二、新生鼠HIE模型的鉴定 所有HIE模型鼠在缺氧缺血过程中相继出现烦躁不安、气促、发绀、肌肉颤动、全身抖动、站立不稳、不能翻身，行走时右后肢拖步、夹尾右旋，复氧后1h，表现为固定向左侧旋转运动。 制作的病理切片表明，显微镜下见正常对照组大脑组织结构层次清晰，细胞轮廓正常，核居中，核仁清楚。PBS对照组和HIE手术组大脑组织破坏严重，以大脑皮质、纹状体、海马损伤最严重，大量神经元核固缩、裂解、坏死，结构紊乱、空泡形成，病灶周围出现胶质细胞增生，随着时间推移，神经元变性坏死趋于稳定，增生的胶质细胞增多，大脑皮层、纹状体、海马等部位形成胶质瘢痕。MSCs移植组的大脑皮层、纹状体、海马等部位神经元坏死，胶质细胞增生的程度较PBS组和HIE手术组轻，结构基本正常，无空泡形成。 三、大鼠改良神经功能损害评分 正常对照组大鼠无神经功能损害，其余3组在HIE模型制作后，各实验时间点均有神经功能损害。MSCs移植组大鼠在移植后前7天，神经功能损害评分与PBS对照组和HIE手术组无明显差异(P>0.05)，移植后7d～14d，MSCs移植组神经功能损害评分[5.0±0.707，4.4±1.14]均较PBS对照组[6.8±1.483，6.4±1.14]和HIE手术组[7.0±1.0，6.0±0.707]低(P1<0.05，P2<0.05)。 四、MSCs移植对新生鼠HIE脑内GDNF、bFGF、IL—6含量的影响 MSCs移植使HIE新生鼠脑内GDNF含量增加。MSCs移植组的GDNF含量3d达到高峰，之后开始下降，14d仍处于较高水平，GDNF含量于1d(67.95±2.59)、3d(72.84±4.28)、7d(69.5±1.55)、14d(68.23±3.59)均高于PBS对照组、HIE手术组和正常对照组(P<0.05)。 MSCs移植使新生鼠HIE脑内bFGF含量明显升高，1d(5.527±0.2285)、3d(5.577±0.1698)、7d(5.4117±0.1123)、14d(5.3074±0.0313)与PBS组、HIE手术组及正常对照组的差异均显著(P<0.05)，而PBS对照组及HIE手术组7d～14d的bFGF含量也较正常对照组高(P<0.05)。 各组HIE新生鼠脑内的IL—6含量均较正常对照组低，其中PBS对照组及HIE手术组的降低有统计学意义(P<0.05)，而MSCs移植组1d(29.36±1.96)、3d(32.10±2.96)、7d(33.53±4.36)、14d(32.13±2.97)的IL—6含量比PBS对照组及HIE手术组的明显升高(P<0.05)，与正常对照组水平相当，无统计学差异(P<0.05)。 结论： 1、在适宜的体外条件下，可从大鼠骨髓中分离培养出MSCs，并且在体外可以大量扩增、纯化MSCs； 2、MSCs经尾静脉移植到缺氧缺血性脑病的新生SD大鼠7-14d后，实验鼠的神经功能有所改善，组织病变程度减轻； 3、MSCs移植使HIE新生鼠脑内GDNF、bFGF含量明显升高，使IL—6含量维持在正常水平。推测MSCs移植改善神经功能的机制是MSCs合成和促进分泌多种细胞因子，这些因子发挥神经保护及修复作用，或引起自身神经干细胞增殖分化为相应类型的神经细胞，促进自我修复作用。