NF-κB圈套策略对神经母细胞瘤细胞增殖及凋亡的影响

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目的:本实验研究环状哑铃形圈套寡核苷酸(Circular dumbbelloligodeoxynucleotides,CD-ODN)转染对核因子-κB (Nuclear factor kappa B,NF-κB)活性和神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖及细胞凋亡的影响,进一步检测凋亡抑制蛋白Survivin的表达情况,探索神经母细胞瘤基因治疗的新靶点。方法:电穿孔法将CD-ODN转染神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系,以未转染基因的SK-N-SH细胞为空白对照。本实验大致分三个部分:1、转染CD-ODN后NF-κB活性的变化:免疫激光共聚焦显微镜下观察细胞内NF-κB核转位情况变化;酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay,ELISA)检测细胞内NF-κB p65表达的变化。2、转染CD-ODN后SK-N-SH细胞生物活性的变化:四甲基偶氮唑蓝比色法(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)检测转染CD-ODN后SK-N-SH细胞体外增殖活性的变化;流式细胞仪技术(Flow cytometry,FCM)检测转染CD-ODN对SK-N-SH细胞凋亡的影响。3、NF-κB活性抑制后凋亡抑制蛋白Survivin的表达变化:蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测NF-κB活性抑制后凋亡抑制蛋白Survivin的表达情况,初步研究NF-κB与Survivin的关系。每个实验重复三次。采用统计学方法分析实验数据。结果:免疫激光共聚焦显微镜观察显示转染CD-ODN组SK-N-SH细胞细胞核荧光较空白对照组明显减弱;NF-κB p65ELISA结果显示转染24、48、72h后转染CD-ODN组SK-N-SH细胞吸光度值A明显低于空白对照组(p<0.05),表明转染CD-ODN后SK-N-SH细胞NF-κB p65蛋白表达下降,NF-κB活性受到抑制。MTT检测细胞增殖力,结果发现,转染CD-ODN组细胞MTT曲线幅度更小,以正常SK-N-SH细胞为对照,转染后24、48、72h的细胞生长抑制率分别为12%、29%、42%(p<0.05);流式细胞仪Annexin V/PI双染色法检测结果发现转染CD-ODN48h后,转染CD-ODN细胞组和空白对照组的细胞凋亡率分别为(23.01±0.71)%和(15.84±0.36)%(p<0.05),转染CD-ODN后细胞早期凋亡率增加。Western blotting结果发现与正常对照组比较,转染CD-ODN组SK-N-SH细胞凋亡抑制蛋白生存素(Survivin)的表达明显下降。结论:CD-ODN能抑制神经母细胞瘤SK-N-SH细胞内NF-κB活性,抑制肿瘤细胞增殖,诱导神经母细胞瘤肿瘤细胞早期凋亡,并且下调凋亡抑制蛋白Survivin的基因表达。这些实验结果表明,CD-ODN可能通过阻断NF-κB信号传导通路来诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,为以NF-κB为靶点的神经母细胞瘤基因治疗提供理论依据。
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