细胞自噬是将细胞组分包裹进具有双层膜结构的自噬体,并运送至液泡/溶酶体降解的过程。源自内质网的COPⅡ囊泡是自噬体的重要膜来源,其广为人知的生物学功能是内质网到高尔基体物质运输,在饥饿诱导自噬发生时,COPⅡ囊泡可以转移到自噬通路供膜。SEC24是COPⅡ囊泡上的衣被蛋白,哺乳动物细胞的SEC24有四种亚型:SEC24A、SEC24B、SEC24C和SEC24D,并根据同源性分成两组(SEC24A/SEC24B和SEC24C/SEC24D)。不同亚型在哺乳动物细胞自噬中的作用尚未明确,为解决这一问题,本课题从单敲低SEC24A、SEC24B、SEC24C、SEC24D亚型以及双敲低SEC24A/SEC24B、SEC24C/SEC24D亚型入手,检测不同SEC24亚型对哺乳动物细胞自噬的影响,鉴定调控自噬的SEC24亚型并解析其作用位点。本文首先在HeLa细胞中对SEC24四种亚型SEC24A,SEC24B,SEC24C和SEC24D利用si RNA干扰技术对其进行单敲低,并对SEC24A/SEC24B和SEC24C/SEC24D进行了组合敲低,并通过Western Blot和QPCR验证了敲低效果。通过对敲低的细胞系进行饥饿处理,诱导自噬发生。Western Blot和免疫荧光实验检测自噬底物蛋白p62和自噬标志蛋白LC3-II的水平,实验结果表明,当敲低SEC24A和SEC24D时,饥饿条件下LC3-II水平低于对照组,且胞内有自噬底物p62积累,提示饥饿诱导的自噬通路受阻。在敲低SEC24A和SEC24D的细胞中,Bafilomycin A1处理后LC3-II水平有提升,且依旧低于对照组,提示自噬缺陷发生在自噬通路早期自噬体形成阶段。而SEC24B的敲低对于饥饿诱导的自噬活性没有明显影响。当敲低SEC24C时,饥饿条件下LC3-II水平高于对照组,且胞内自噬底物p62减少,提示饥饿诱导的自噬活性增加。反而与敲低SEC24D的敲低效果相反。因此SEC24A/SEC24B组合敲低抑制自噬的效果主要通过敲低SEC24A实现,SEC24C/SEC24D组合敲低不影响自噬的效果主要由于敲低SEC24C与敲低SEC24D所呈现的自噬效果相反。由此明确SEC24参与饥饿诱导的自噬通路,且参与的亚型为SEC24A和SEC24D。随后本文解析SEC24A和SEC24D调控自噬通路的位点。利用RFP-GFPLC3串联荧光检测自噬体和自噬溶酶体的数目,发现敲低SEC24A或者SEC24D的细胞中,自噬体和自噬溶酶体的数目都降低,说明自噬缺陷发生在自噬通路早期自噬体形成阶段,与LC3-II的Western Blot结果一致。随后利用蛋白酶K敏感性实验,鉴定自噬缺陷发生在自噬体闭合之前或者之后,通过比较无表面活性剂条件下,GFP-LC3和p62对蛋白酶K的敏感性,发现当SEC24A或SEC24D表达量降低,GFP-LC3和p62对蛋白酶K的敏感性增加,说明不受自噬体保护,自噬缺陷发生在自噬体闭合之前。最后本文通过免疫荧光检测SEC24A或SEC24D敲低对自噬通路上ATG复合物的影响,发现当SEC24A和SEC24D表达量降低时,饥饿诱导的ATG16L1、ATG14L点状结构数目下降,而ATG9A点状结构数目没有明显变化。且SEC24A或SEC24D敲低会导致LC3与ATG16L1、ATG14L、ATG9A共定位增加。以上结果提示SEC24A或SEC24D作用在ATG16L1、ATG14L上游,并导致ATG蛋白在早期自噬膜结构积累。综上所述,本课题首先明确了哺乳细胞中SEC24在饥饿诱导的自噬通路中的重要作用,并鉴定了对自噬有影响的亚型SEC24A和SEC24D,随后鉴定了SEC24A或SEC24D作用在自噬较早期阶段——自噬体闭合之前,并进一步发现SEC24A或SEC24D敲低影响ATG16L1、ATG14L点状结构的形成,并导致ATG蛋白在早期自噬膜结构积累。本课题首次揭示哺乳动物细胞中SEC24不同亚型在饥饿诱导的自噬过程中的重要作用及作用位点,不仅有助于深化对自噬体形成过程和分子机制的了解,并为全面解读COPⅡ囊泡及其衣被蛋白在自噬中的重要作用提供了信息。