论文部分内容阅读
目的：1、探讨胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)类似物利拉鲁肽(liragrutide)对肥胖非糖尿病小鼠和糖尿病肥胖小鼠血糖和体重的影响,并研究其作用与胰岛素敏感组织中工Ⅲ型腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase3, AC3)基因和蛋白表达水平的关系。2、探讨利拉鲁肽对肥胖和非肥胖2型糖尿病患者血AC3、糖代谢、体重和胰岛素抵抗的影响,以及AC3和胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)及肥胖的相关性。3、观察利拉鲁肽对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVECs) AC3表达的影响。方法：1、动物实验：选取C57BL/6J小、鼠和db/db基因鼠(2型糖尿病肥胖模型)。C57BL/6J小鼠随机分为3组(C57普料组、C57高脂干预组和C57高脂未干预组),每组8只,每实验组雌雄配对：两实验组C57BL/6J小鼠给予高脂饲料(含34.9g%的脂肪和26.2g％蛋白质)为C57高脂干预组和C57高脂未干预组,另一实验组C57BL小鼠给予普通饲料(4.5g%的脂肪和4.5g%蛋白质)为C57普料组。db/db小鼠16只,分为2组(db干预组和db未干预组),每组8只,每实验组雌雄配对。每周测量体重和尾静脉随机血糖。从第12周开始,一组肥胖C57BL/6J小鼠即C57高脂干预组和db干预组小鼠给予皮下注射利拉鲁肽100μg/kg,每日两次,其余三组给予等量生理盐水作为对照,进行12周后摘取眼球采内眦静脉血,迅速取出脂肪、肝脏、肌肉、大小肠连接处组织,行TaqMan Realtime PCR技术检测组织细胞AC3mRNA的表达和蛋白免疫印迹法Western blot技术检测组织细胞AC3蛋白的表达。静脉血离心取上清液行胰岛素检测。2、临床部分：按照标准选取NGT组32例和T2DM组25例,再根据体质指数(BMI)分为2个亚组,BMI≥28Kg/m2为肥胖组；18.5Kg/m2≤BMI<24Kg/m2为非肥胖组。NGT肥胖组15例,男8例,女7例,NGT非肥胖组17例,男9例,女8例；T2DM肥胖组12例,男6例,女6例,T2DM非肥胖组13例,男7例,女6例。T2DM组给予利拉鲁肽0.6mg每日一次,皮下注射,1周后加量至1.2mg,连续16周,NGT肥胖组予以健康教育。所有研究对象清晨空腹检测以下指标,身高(m)、体重(kg)、体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)、空腹血糖、HbAic、HDL-C、TG、TC和LDL-C、AC3水平,计算HOMA-IR;每4周随访一次,共随访16周。3、细胞实验：分别用不同浓度的利拉鲁肽(0、10、100nmol/L)处理HUVECs8h、24h后抽提总RNA,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及Western blot方法检测AC3mRNA及蛋白的表达。结果：1、动物部分：利拉鲁肽能显著促进肥胖非糖尿病小鼠和肥胖糖尿病小鼠AC3mRNA和蛋白的表达,减轻体重,改善血糖(p＜0.01)。利拉鲁肽治疗12周,db/db小鼠,与未干预组比较,干预组体重、血糖均下降,胰岛素升高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。C57BL/6J小鼠3组间血糖无差异；C57高脂无干预组与C57普料组比较,体重、胰岛素明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)；C57高脂干预组与高脂未干预组比较,体重、胰岛素明显减低,差异有统计学意义(P＜0.05)。各组小鼠脂肪细胞、肝脏、骨骼肌、大小肠连接处AC3mRNA表达的比较：db/db小鼠,干预组较未干预组AC3mRNA表达明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。C57BL小鼠,与普通饲料无干预组比较,高脂未干预组AC3mRNA表达明显减低,差异有统计学意义(P＜0.05)；高脂干预组AC3mRNA表达明显增加有统计学意义(P＜0.05)。2、临床部分：(1)T2DM非肥胖组：利拉鲁肽治疗16周后FPG、HbA1C、 HOMA-IR和胰岛素水平下降有统计学意义(P<0.05), HDL-C、AC3升高有显著意义(P<0.05)。(2)T2DM肥胖组：利拉鲁肽治疗后体重、BMI、WHR、 FPG、HbA1、胰岛素、HOMA-IR值显著降低(P<0.05), TC、HDL-C、AC3较治疗前升高(分别为P<0.05, P<0.01)。(3)T2DM肥胖组体重、BMI、WHR下降较非肥胖组显著(分别为P<0.01,P<0.05),AC3升高有显著意义(P＜0.01)。(4)统计相关分析显示：AC3与体重、BMI、WHR、HOMA-IR呈负相关(分别为r=-0.254, P<0.01, r=-0.228、P<0.05, r=-0.703、P<0.01, r=-0.212、P<0.05)。利拉鲁肽治疗后效果,FPG下降与治疗前FPG、HbA1c、 HOMA-IR呈正相关(分别为r=0.914、P<0.01, r=0.771、P<0.01, r=0.194, P<0.05),Stepwise多元逐步回归分析示AC3升高与治疗前治疗前体重、BMI、 HOMA-IR呈负相关,与治疗前AC3水平正相关；以AC3为因变量,体重、BMI、 WHR、HOMA-IR、FPG、HbA1c、TG、TC、HDL-C和LDL-C为自变量进行多元逐步回归分析,结果显示体重、BMI、WHR、HOMA-IR最后进入回归方程,方程校正后r2=0.542,P=0.001。3、利拉鲁肽(10nmol/l)干预8小时、24小时的AC3mRNA表达均有显著意义(P＜0.01),内皮细胞AC3蛋白表达随着时间的延长而呈上升趋势(P＜0.01)。利拉鲁肽和HUVECs共培养24小时后,随着GLP-1浓度(0、10、100nmol/L)的增加,AC3mRNA表达水平明显增加(P＜0.01),蛋白表达水平明显上升(P＜0.01),NaN3对AC3的表达没有影响。结论：1、AC3与体重、BMI、WHR、HOMA-IR呈负相关,利拉鲁肽干预后可以增加AC3的水平,不论是实验动物还是患者的高体重和胰岛素抵抗可以通过利拉鲁肽的干预来逆转。2、利拉鲁肽对HUVECs AC3表达的影响显示AC3的表达随着利拉鲁肽的浓度以及时间的延长而呈上升趋势。