肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是严重影响人类生命健康的恶性肿瘤之一,其发病率和致死率在世界范围内分别处于第五位和第三位。我国HBV感染人数众多,肝细胞肝癌患者约占全球的55%,并且新发病例有年轻化的趋势。肝细胞肝癌进展快、病程短,治疗困难。尽管随着科学技术的进步,肝移植、微波治疗及介入治疗等新手段逐步应用,然而其治疗效果有限。迄今手术切除配合术后化疗仍是肝细胞肝癌的最常用治疗方案,但肝癌术后的高复发率及肝癌化疗后产生的耐药性严重限制了肝癌治疗效果。因此,探讨肝细胞肝癌发生机制,寻找肝癌治疗有效新手段成为目前研究的热点。ZHX2(zinc finger homodomain box2)是最早在小鼠中发现的转录抑制因子,其人类的同源基因在2003年被成功克隆。ZHX2不但自身可形成同源二聚体,而且能与其家族的另外两个成员ZHX1和ZHX3及转录因子NF-YA(A submit of nuclear factor Y)形成异源二聚体。体外实验发现,在SL2细胞中ZHX2通过与转录因子NF-YA相互作用,进而抑制cdc25C基因启动子的活性,提示ZHX2可能参与调控细胞周期。近期研究显示ZHX2与疾病相关。多发性骨髓瘤患者ZHX2表达与疾病的预后相关,且ZHX2高表达患者对化疗药物的反应性明显好于ZHX2低表达患者,提示ZHX2参与骨髓瘤发生,并可能与肿瘤的耐药性相关。国外学者及本实验室前期研究证明,ZHX2能够明显下调肝细胞肝癌重要标记分子AFP(a-Fetoprotein)、GPC3(Glypican-3)和H19的表达。但ZHX2表达与肝细胞肝癌相关性的研究报道不一：有研究显示肝细胞肝癌中ZHX2因启动子区的高度甲基化而低表达,且ZHX2表达与病人生存时间正相关；另有研究报道：恶性程度越高的HCC组织中ZHX2的表达反而升高。明确ZHX2在HCC发生发展中的作用及其分子机制,不仅有助于揭示HCC发生机制,并且可以为肝细胞肝癌的早期诊断及治疗提供新思路。本课题拟深入研究ZHX2在肝细胞肝癌发生中的作用及其分子机制,并对其在肝细胞肝癌治疗中的可能应用进行初步探讨。第一部分ZHX2抑制肝细胞肝癌增殖的作用及其分子机制研究ZHX2是转录因子ZHX家族的成员之一,2004年被证明参与BalB/cJ小鼠AFP出生后抑制,并通过定位克隆方法确定为Afrl (Alpha fetal protein regulator1)候选基因。ZHX2可以调控肝癌重要标志物AFP及GPC3的表达,提示其参与HCC发生。但目前ZHX2与HCC相关性的报道不一,ZHX2在HCC发生中的作用及其机制迄今尚未见报道。为明确ZHX2在肝细胞肝癌组织中的表达情况,揭示ZHX2对于肝癌细胞增殖的抑制作用并阐明其分子机制,本研究进行了系列体内外实验,得到以下结果：第一,ZHX2显著抑制肝癌细胞生长1.ZHX2在体外抑制肝癌细胞系的增殖：利用脂质体转染技术分别在ZHX2低表达的肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中转入pcZHX2及对照pcDNA3.0,在ZHX2高表达的肝癌细胞系SMMC7721和QSG7701中转入针对ZHX2的shRNA表达质粒(ps1674和ps2360),转染后每隔24h测得OD值,并绘制细胞的生长曲线。结果表明,在HepG2和HepG2.2.15中过表达ZHX2后能明显抑制细胞的生长(p<0.001)；而在SMMC7721和QSG7701中干扰ZHX2后细胞增殖能力明显增强(p<0.001)。2.ZHX2明显降低肝癌细胞系的克隆形成能力：同上在HepG2和HepG2.2.15细胞中过表达ZHX2,在SMMC7721和QSG7701细胞中干扰ZHX2的表达,转染24h后消化细胞,然后将消化的细胞接种于6孔板,8-12d后结晶紫染色并统计细胞的克隆数目。结果表明,ZHX2过表达显著抑制HepG2和HepG2.2.15细胞的克隆形成能力(p<0.001)；而抑制ZHX2后SMMC7721和QSG7701细胞的克隆数目明显增加(p<0.001)3.ZHX2显著抑制荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长：1×107的HepG2.2.15细胞皮下接种裸鼠,制备荷瘤鼠。当肿瘤直径达到0.5cm时,按肿瘤大小随机分成两组,分别瘤内注射pcZHX2或pcDNA3.0质粒,每4d注射一次,每次20μg,共四次。定期测量肿瘤直径计算肿瘤的体积。质粒注射后20d处死动物,取肿瘤,称重。RT-PCR结果表明瘤内注射pcZHX2后肿瘤细胞内ZHX2表达显著升高(p<0.05)。肿瘤生长曲线分析及瘤重检测结果表明,ZHX2过表达能够明显抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长(p<0.05)。免疫组化染色结果显示,pcZHX2注射组肿瘤组织中Ki67阳性细胞数明显低于pcDNA3.0注射组(p<0.001),提示ZHX2抑制细胞增殖。第二,ZHX2通过下调CyclinA和CyclinE的表达将细胞阻滞在G0/G1期。1.流式检测发现ZHX2高表达导致肝癌细胞G0/G1期阻滞：利用脂质体转染技术分别在ZHX2低表达的肝癌细胞系HepG2中转入质粒pcZHX2表达质粒,在ZHX2高表达的肝癌细胞系SMMC7721中转入针对ZHX2的shRNA表达质粒(ps1674和ps2360)；48h后收集细胞,PI染色后流式检测分析细胞周期。结果表明,HepG2中过表达ZHX2后,G0/G1期的百分比显著升高(67.2±0.14vs.58.2±2.12); SMMC7721细胞中抑制ZHX2后,G0/G1期的百分比(ps1674,54.3±0.28; ps2360,56.4±2.82)明显低于对照组(66.4±4.03)2.ZHX2显著抑制肝癌细胞Cyclin A和Cyclin E的表达：同上利用脂质体转染技术建立ZHX2过表达和干扰的肝癌细胞模型。转染48h后收集细胞的总蛋白和RNA,分别用Western blot和RT-PCR技术检测细胞周期相关蛋白表达。结果显示,ZHX2显著下调周期蛋白Cyclin A和Cyclin E的表达,而对细胞周期抑制因子p21和p27及周期蛋白Cyclin D1表达没有影响。第三,ZHX2与CyclinA和Cyclin E启动子区结合并抑制其转录是ZHX2抑制肝癌细胞增殖的重要机制。1.ZHX2显著抑制Cyclin A和Cyclin E启动子活性：为进一步研究ZHX2对Cyclin A、Cyclin E的转录抑制作用,本研究首先构建Cyclin A、Cyclin E启动子报告质粒：设计引物,以人外周血DNA为模板PCR扩增Cyclin A (-505～+361)和Cyclin E(-402～+72)启动子区DNA,分别克隆到报告载体pGL3-basic HindⅢ/Sac Ⅰ位点和HindⅢ/Xho Ⅰ位点,酶切和测序分析结果证明报告质粒构建成功。利用脂质体转染技术将构建成功的报告质粒分别与pcZHX2共转染HepG2细胞中,48h后收集细胞蛋白,荧光素酶活性检测发现,与对照组相比,ZHX2显著抑制Cyclin A、Cyclin E启动子活性(p<0.01)。2.ChIP实验结果表明ZHX2能与CyclinA、CyclinE启动子区结合：将HepG2细胞种于6cm dish,24h后分别转染pcZHX2(其中ZHX2基因C端融合HA-tag)(4μg)和pcDNA3.0(4μg),转染48h后经甲醛交联,收集细胞裂解液并超声处理,利用HA抗体沉淀目的DNA,纯化并回收后进行PCR扩增。结果发现pcZHX2转染组沉淀DNA中能够特异性扩增CyclinE (-401～-278)和CyclinA (-316～-207)片段,但不能扩增Cyclin D1启动子片段；而对照组沉淀DNA不能获得特异性扩增。证明ZHX2能与CyclinA和CyclinE启动子区结合。3.抑制肝癌细胞中Cyclin A、Cyclin E的表达可以抵消ZHX2对细胞增殖的抑制作用：利用脂质体转染技术在ZHX2高表达细胞系SMMC7721和QSG7701中抑制ZHX2表达的同时干扰Cyclin A和Cyclin E的表达。结果表明,抑制Cyclin A和Cyclin E的表达可以抵消干扰ZHX2对细胞增殖和克隆形成的促进作用,但是抑制Cyclin D1的表达则没有此种作用。第四,肝癌组织中ZHX2核表达明显减少,并且ZHX2表达与HCC进展显著相关。1.肝癌癌旁组织中ZHX2核表达显著高于癌组织,并且ZHX2核表达与肿瘤病理分级相关：收集82例肝癌癌组织和78例配对癌旁组织,免疫组化检测ZHX2表达,分别对ZHX2胞浆和胞核表达进行评分,并与不同临床指标进行相关性分析。结果表明：癌旁组织中ZHX2核表达率较癌组织(70.5%vs.53.7%,p=0.0282)明显升高；在直径小于5cm的肿瘤中也得到同样的结果。相关性分析发现,ZHX2核表达与肿瘤分化程度正相关。进一步提取新鲜肝癌组织的胞核蛋白,Western blot检测ZHX2表达,结果与免疫组化一致,即癌旁组织中ZHX2核表达明显高于癌组织。2.肝癌组织中ZHX2核表达与CyclinA、CyclinE和Ki67的表达负相关：制备肝癌组织标本的连续切片,免疫组化结果表明,肝癌细胞中Cyclin A、 Cyclin E和Ki67的表达与ZHX2核表达负相关。3.组织芯片检测发现ZHX2表达与肿瘤微血管密度及肝癌细胞增殖程度显著负相关,且与患者术后生存时间显著正相关：购买106点人类肝癌组织芯片,免疫组化检测ZHX2、CD31及Ki-76表达,并进行相关性分析。结果表明,癌组织中ZHX2的核表达水平明显低于癌旁组织,且ZHX2胞核表达水平与肿瘤分化程度正相关、与肿瘤微血管密度(CD31)及肝癌细胞增殖程度(Ki-67)显著负相关,ZHX2核内表达水平与患者术后生存时间显著正相关,提示,ZHX2表达与HCC的预后正相关。第五,ZHX2对肝癌细胞增殖的抑制作用依赖于其核定位能力。1.成功构建保留及缺少核定位信号的ZHX2表达质粒pZHX2(242-446)和pZHX2(242-439):设计引物,以pcZHX2为模板,PCR扩增ZHX2全长、ZHX2(242-446)(含核定位信号)和ZHX2(242-439)(核定位信号缺失)片段,并克隆至表达载体pEGFP-N1的EcoR Ⅰ和Kpn Ⅰ位点,酶切及测序鉴定证实载体构建成功。上述质粒及对照质粒pEGFP-N1分别转染CHO和HEK293细胞,48h后DAPI进行细胞核染色,荧光显微镜观察发现,融合蛋白EGFP-ZHX2和EGFP-ZHX2(242-446)定位在细胞核而EGFP-ZHX2(242-439)定位在细胞浆。提取上述细胞的胞浆和胞核蛋白,Western blot检测EGFP表达,结果与免疫荧光结果一致。2.ZXH2抑制HepG2细胞中Cyclin A和Cyclin E启动子活性依赖于其核定位能力：将保留核定位信号的表达载体pZHX2(242-446)和缺失核定位信号的表达载体pZHX2(242-439)各0.75μg分别与0.25μg的启动子报告质粒pGL3-Ap和pGL3-Ep共转染HepG2细胞,48h后收集细胞蛋白。荧光素酶双报告基因检测结果显示：EGFP-ZHX2(242-446)能够显著抑制Cyclin A和Cyclin E启动子的活性,而失去核定位能力的EGFP-ZHX2(242-439)不能抑制Cyclin A和CyclinE启动子活性。3.ZHX2对肝癌细胞增殖的体内外抑制作用依赖于其核定位能力：pZHX2(242-446)、pZHX2(242-439)和pEGFP-N1分别转染HepG2细胞,每隔24h对细胞进行计数,并绘制细胞的生长曲线。结果显示,pZHX2(242-446)转染能够明显抑制HepG2细胞的增殖,但核定位信号缺失的pZHX2(242-439)转染组细胞生长不被抑制。进一步建立HepG2.2.15荷瘤鼠模型,当肿瘤直径达到0.5cm时随机分组并分别瘤内注射质粒pZHX2(242-446)、pZHX2(242-439)和pEGFP-N1各20μg,每四天注射一次共三次。瘤体生长曲线及瘤重分析结果均显示,pZHX2(242-446)能够明显抑制裸鼠体内HepG2.2.15细胞的增殖,但缺失核定位信号的pZHX2(242-439)则没有此抑制作用。综上,本研究通过系列体内外实验首次证明了ZHX2对肝癌细胞的抑制作用,并阐明了其分子机制。研究证明ZHX2通过结合Cyclin A/cyclin E启动子区,抑制其转录,从而抑制肝癌细胞的增殖。缺失实验显示ZHX2的核定位与其对肝癌细胞的抑制作用密切相关。临床检测表明,肝癌细胞中ZHX2核内表达明显降低,该事件可能发生在HCC早期,且ZHX2核内表达与肝癌细胞增殖及肿瘤血管密度负相关,与患者术后生存率正相关,提示,ZHX2核内表达降低是HCC进展的重要因素。第二部分ZHX2增强肝癌细胞化疗敏感性的作用及其机制研究化疗是肝细胞肝癌治疗的重要手段之一,但肝癌细胞耐药性的产生严重影响其治疗效果。多种研究证实,利用基因治疗联合化疗可以有效提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,进而提高化疗效果。因此探讨并发现新的可以促进肝癌细胞化疗敏感性的靶基因具有重要意义。近期研究发现,ZHX2的表达与多发性骨髓瘤患者的药物治疗效果显著相关,提示ZHX2可能促进多发性骨髓瘤细胞的化疗敏感性。ZHX2能否增强肝癌细胞的化疗敏感性,并应用于与化疗的联合治疗成为我们关注的关键问题。为阐明此问题,本研究选择在肝细胞肝癌治疗中广泛应有的化疗药物顺铂(Cisplatin, CDDP)利用体内外实验研究ZHX2基因转染影响肝癌细胞CDDP敏感性的作用并探讨其分子机制,进而验证ZHX2对多种化疗药物敏感性的作用。主要研究结果如下：第一,ZHX2明显增强肝癌细胞系对CDDP的敏感性1.ZHX2显著增强肝癌细胞系对CDDP的敏感性：HepG2、HepG2.2.15和BEL7402细胞分别种于96孔板,并转染pcZHX2及对照质粒pcDNA3.0,24h后用CDDP处理,24h后CCK-8测定OD值。结果显示,ZHX2与CDDP联合处理组的细胞存活率明显低于ZHX2和CDDP单独处理组及对照组(p<0.05)。提示,ZHX2能够促进体外肝癌细胞系的化疗敏感性。2.ZHX2显著降低CDDP作用肝癌细胞系的IC50值：按照上述实验方法利用脂质体转染技术建立HepG2、HepG2.2.15和BEL7402过表达ZHX2的细胞模型。模型建立成功后,用倍比稀释药物的培养基继续培养细胞24h,然后加入CCK-8测定OD值。利用GraphPad Prism5计算药物的IC50值。统计结果显示无论是在ZHX2低表达的HepG2和HepG2.2.15细胞中还是在ZHX2表达相对较高的BEL7402细胞中过表达ZHX2后,CDDP对肝癌细胞的IC50均显著降低(p<0.05)3.ZHX2显著增强CDDP诱导肝癌细胞系凋亡的能力：CDDP主要通过干扰DNA修复机制,诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞。为验证ZHX2增强肝癌细胞系对CDDP敏感性的作用,我们进一步研究了ZHX2对CDDP诱导肝癌细胞凋亡的影响。Annexin V/PI双染及细胞周期分析结果均显示,ZHX2转染联合CDDP作用24h后,细胞凋亡明显高于单独作用组(p<0.001)。与此相符,Hochest33258或DAPI染色结果显示,ZHX2与CDDP联合作用HepG2后多型核细胞明显增多(p<0.001),进一步提示,ZHX2增强CDDP诱导的肝癌细胞凋亡4.ZHX2与CDDP联合处理HepG2细胞上调caspase依赖的凋亡相关蛋白的表达：HepG2细胞接种到6孔板后过表达ZHX2,然后用CDDP处理24h,收集实验组和对照组的总蛋白及胞浆蛋白。Western blot检测ZHX2、caspase-3、caspase-9、PARP、Bcl-2和cytochrome c的表达。结果显示过表达ZHX2后再用CDDP处理HepG2,显著促进caspase-3、caspase-9和PARP的剪切,并增加cytochrome c向细胞胞浆中的释放。第二,ZHX2显著增强荷瘤鼠体内肝癌细胞对CDDP的敏感性。1.ZHX2过表达显著增强CDDP对荷瘤裸鼠体内肝癌细胞的抑制作用：按照第一部分的方法进行裸鼠成瘤,随机分组后分别用pcZHX2(20μg)联合CDDP(80μg)、pcDNA3.0(20μg)联合CDDP(80μg)及pcZHX2(20μg)和pcDNA3.0(20μg)单独进行瘤内注射。每隔4d处理一次共处理4次。隔天测量肿瘤直径计算肿瘤的体积绘制肿瘤生长曲线。第16d处死裸鼠剥离肿瘤称重后,将肿瘤组织进行石蜡包埋、制备切片,免疫组化检测ZHX2表达。结果显示,pcZHX2注射组的肿瘤组织切片中ZHX2染色强度和ZHX2阳性细胞数目都明显高于pcDNA3.0注射组,提示质粒瘤内注射后ZHX2在肿瘤细胞中过表达。瘤重和肿瘤生长曲线检测结果显示,pcZHX2联合CDDP处理组较其它各组有更明显的抑瘤效果(p<0.05)。2.ZHX2过表达明显促进CDDP介导的裸鼠体内肿瘤细胞凋亡：上述各组瘤体组织切片脱蜡后,TUNEL染色。荧光显微镜观察发现,pcZHX2联合CDDP处理组肿瘤组织中凋亡细胞的比例显著高于其它各组(p<0.001)第三,ZHX2促进肝癌细胞化疗敏感性的分子机制研究多药耐药基因1(mutiple drug resistance1, MDR1)编码蛋白能够有效的帮助肿瘤细胞将药物泵出,从而降低细胞内有效药物浓度。众多文献证实,肿瘤细胞内MDR1表达升高是肿瘤细胞多种耐药性产生的重要机制。因此,维持药物在细胞中的有效浓度,减少细胞对药物的外排作用是提高肿瘤细胞化疗敏感性的重要手段。MDR1基因的启动子区含有NF-YA的结合位点,而已有研究证实ZHX2能够与NF-YA结合抑制多种基因的转录。据此,我们推测,ZHX2可能通过调控MDR1表达,抑制细胞对药物的外排,进而促进肝癌细胞化疗敏感性。为验证上述假说,本部分进行了系列研究,并得到以下结果：1.ZHX2抑制肝癌细胞对药物的外排能力：pcZHX2及对照质粒pcDNA3.0脂质体转染HepG2细胞,48h后收集细胞并用可自发荧光的PI或ADM(Doxorubicin)处理4h,流式细胞仪分析细胞内的平均荧光强度。结果表明,ZHX2转染HepG2细胞PI处理后细胞内荧光强度均显著高于对照组(p<0.05),提示ZHX2组可以有效抑制细胞药物外排能力,提高细胞内药物浓度。2.ZHX2在转录水平抑制MDR1的表达：pcZHX2脂质体转染HepG2、 HepG2.2.15和BEL7402细胞,建立ZHX2过表达细胞模型,提取细胞总RNA, RT-PCR检测MDR1基因的mRNA水平。结果显示,ZHX2过表达细胞MDR1基因的mRNA表达水平明显低于pcDNA3.0转染的对照组细胞。3.ZHX2抑制MDR1启动子的活性,该作用依赖于转录因子NF-YA:克隆MDR1基因启动子的核心序列并克隆到报告质粒pGL3上,构建报告质粒pGL3-Mp。利用脂质体转染技术将pcZHX2(0.75μg)和pGL3-Mp (0.25μg)共转染肝癌细胞HepG2、HepG2.2.15和BEL7402细胞,pcDNA3.0和pGL3-Mp共转染组为对照。双荧光素酶检测结果显示,在三种细胞中ZHX2都能明显抑制MDR1启动子活性。已有文献报道,ZHX2能够与转录因子NF-YA结合并抑制NF-YA下游靶基因表达。为研究NF-YA在ZHX2介导的MDR1抑制中的张作用,我们在上述共转染模型中转染针对NF-YA的siRNA(2μl)抑制其表达。结果显示：与对照组相比,转染NF-YA siRNA组细胞中ZHX2对MDR1启动子活性的抑制作用明显减弱。提示,ZHX2通过转录因子NF-YA抑制MDR1启动子的活性。4.ZHX2能够显著促进肝癌细胞对多种依赖于MDR1机制化疗药物的敏感性：为验证ZHX2通过调节MDR1表达促进肝癌细胞化疗敏感性的作用,本研究进一步研究ZHX2对三种化疗药物CDDP、5-Fu和ADM的增敏作用。首先利用脂质体转染技术在肝癌细胞系HepG2中过表达ZHX2后,分别用不同化疗药物处理Oh、24h、48h、72h,测定细胞的OD值计算存活率。结果表明,ZHX2过表达组经药物处理后细胞的存活率均低于药物单独作用组,并且24h和48h的作用效果尤为明显。提示,ZHX2增强肝癌细胞多种化疗药物的敏感性。综上所述,本研究首次证实ZHX2可以有效促进肝癌细胞的化疗敏感性,并研究了其分子机制。体内外实验结果显示,ZHX2能够有效促进CDDP对肝癌细胞的抑制作用,并促进CDDP介导的线粒体通路活化进而促进肝癌细胞凋亡。该作用可能与ZHX2下调MDR1转录从而降低肿瘤细胞对药物的外排能力有关。本研究提示ZHX2是潜在的化疗增敏剂,为开发新的肝癌化疗联合治疗方案提供了新思路。