论文部分内容阅读
前言 脑缺血再灌注后神经损伤的机制是一个复杂的多因素过程，主要与氧化应激反应、炎症反应、钙超载、脑水肿和细胞凋亡等有关。各种造成脑缺血再灌注后神经损伤的因素中，脑水肿是其中重要环节，与其他因素可相互影响。脑缺血再灌注后脑水肿是一种混合性脑水肿，既有血管源性脑水肿，也存在细胞毒性脑水肿。 脑缺血再灌注后脑水肿的原因是多因素的，水孔蛋白（aquaporin，AQP）家族是一组水选择性细胞膜转运蛋白，它可以增加细胞膜的水通透性。研究还发现AQP家族中的AQP4与脑水肿有密切关系。 AQP4主要分布于中枢神经系统胶质细胞膜、室管膜细胞和脉络丛等处，对水的代谢、分布和渗透压的调节发挥重要作用。在有些脑水代谢疾病中，如急性水中毒可检测到AQP4的表达增加。在下调AQP4表达的脑水肿模型中发现，大鼠脑内水含量下降，胶质细胞区域水肿明显减轻，提示AQP4参与了脑水肿的形成。AQP4在缺血性脑水肿的发生机制中同样起重要作用。AQP4mRNA在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中1天后表达微弱上调，3天时表达显著增加，7天后减弱，与缺血性脑水肿的形成和发展相平行，结果支持了AQP4参与了缺血性脑水肿的假说。 目前，国内在脑缺血再灌注损伤中AQP4蛋白表达及其意义的研究鲜有报道，AQP4与脑缺血再灌注损伤很可能有密切关系。我们通过评价AQP4在缺血再灌注后脑组织中的表达情况，来探讨AQP4在脑缺血再灌注后脑梗死水肿的形成、发展过程中的作用，进一步明确AQP4与脑缺血再灌注损伤的关系，深入探讨脑缺血再灌注后脑水肿的发生机制。 实验材料与方法 1．材料与仪器 1．1动物 选用雄性wister大鼠98只，鼠龄3-4个月，体重200-250g（中国医科大学实验动物中心提供） 1 .2主要试剂:（l）一抗:兔抗鼠AQ几单克隆抗体（z）二抗:生物素化二抗（3） SABC免疫组化试剂盒 1 .3主要仪器:（1）石蜡切片机（2）37%孵箱（3）A缈nin罗n Bp 21 ID电子天平体)4℃冰箱（5）80一100℃干燥箱（6） OlymPus CK40相差光学显微镜及照相装置 1.4其他材料:（1）3%的H202一甲醇液（2）PBS缓冲液（3）胰酶（4）正常羊血清（5） 0.05%DAB显色液（6）苏木素、二甲苯及100%一70%不同浓度的酒精（7）10%水合氯醛（8）4%多聚甲醛（19）强力碘（10）切脑模具（11）灌注器（12）尼龙鱼线及缝合线（13）动脉夹及手术器械 2.方法 2.1动物分组大鼠随机分成正常对照组（n=6）、假手术组（n二36）和缺血再灌注组（n二36），后两组分6个时相组，每个时相组6只。 2.2大鼠大脑中动脉栓塞模型制备采用zea longa改良法。 2.3脑组织水含量测定采用干、湿重法。 2 .4常规HE染色，光学显微镜观察。 2.5脑组织中AQ几蛋白表达检测采用免疫组化法。实验结果 1.组织切片HE染色光镜观察 正常对照组、假手术组和缺血对侧脑组织皮层细胞层次分明，神经细胞形态结构正常。缺血再灌注组缺血侧额顶叶皮层、皮层下白质及基底节区神经元减少、排列紊乱，细胞周围间隙增宽，有大量坏死神经元，胞体肿胀、胞浆淡染、胞核溶解、结构不清，梗死边界区可见大量固缩神经元。 2.大鼠脑缺血再灌注后脑水含量 缺血再灌注组左侧脑水含量在12h即明显升高，48h一120h时达到高峰，1 68h时仍处于较高水平。各时相点与右侧、正常组和假手术组两侧脑水含量相比，均有显著性升高（均P<0.005）。而缺血再灌注组右侧、正常组、假手术组两侧脑水含量相比均无差异（P>0.5）。 3.大鼠脑缺血再灌注后脑组织AQP4表达 免疫组化AQ几表达结果显示，在缺血再灌注12h即开始表达，24h表达明显增强，72h达高峰，主要见于缺血灶周围及海马区，表现为阳性着色神经胶质细胞数目增多，呈弥散表达，之后表达逐渐下降，168h仍持续表达;对侧半球、正常组及假手术组相应区域未见明显表达。 4.大鼠脑缺血再灌注后脑组织AQ几表达与脑水含量的相关性分析 AQ几在缺血再灌注12h即开始表达，24h表达明显增强，72h达高峰，168h仍持续表达，但较120h有所下降;脑水含量在12h即明显升高，48h-120h时达到高峰，168h时仍处于较高水平。AQ几表达和脑水含量变化二者呈正相关（r=0.958，p<0.001）。讨论 脑水肿为脑缺血再灌注后神经损伤的一个重要病理环节已愈来愈受到人们的重视，研究发现水孔蛋白家族中的AQP4广泛存在于蛛网膜下腔、血管周围的胶质细胞、室管膜细胞及渗透压感受器官，其可能有调节脑脊液及细胞液体积的功能。Kiening等研究发现，脑缺血72h后AQP4的表达与脑水肿成正比上升，而在AQ几基因敲除鼠模型中脑水肿明显减轻。Taniguchi等研究了大鼠大脑中动脉永久性栓塞后AQ几mRNA表达情况，发现在栓塞周围皮质，第一天AQ几mRNA表达轻微上升，第三天达最高峰，第七天仍处于较高水平，这与用M班测定脑水肿的变化是一致的。以上研究揭示AQ几在脑组织水的代谢调节中起关键作用，并提示AQ几可能参与了脑水肿形成的病理过程。 本实验研究发现脑缺血再灌注后，缺血灶周围及海马区AQ几表达阳性着色神经