论文部分内容阅读
第一章高糖通过ERK1/2细胞信号通路介导抑制STAT3表达对大鼠骨髓来源MAPC细胞TGF-β1及VEGF表达调控目的通过检测高糖对骨髓来源MAPC细胞TGF-β1和VEGF表达水平的影响,探讨高糖干预MAPC细胞TGF-β1和VEGF表达的机制。方法从鼠骨髓来源的细胞中分离、纯化得到MAPC细胞。MAPC细胞依照一定的种植密度孵育在普通细胞培养基(含有5.5mM葡萄糖)和高糖培养基中(含有25.5mM葡萄糖)中,最长孵育时间14天。MAPC细胞孵育在含有左旋葡萄糖(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的高渗培养基中,作为高渗对照,以排除高渗透压对细胞的影响。实验中利用Q-RT-PCR.ELISA以及免疫荧光显微成像分析在不同的时间点和条件培基中MAPC细胞TGF-β1mRNA以及蛋白质表达水平。同时,利用Q-RT-PCR分析VEGF表达水平。通过Western blot分析高糖及普通培养条件下MAPC细胞ERK1/2以及STAT3激活表达水平的差异。通过共聚焦显微镜了解不同培养条件下,STAT3亥转移的能力。结果在普通低糖培养基中孵育的MAPC细胞,处TGF-β1和VEGF的表达均能检测到。在高糖培集中孵育36h后TGF-β1mRNA表达明显升高,为对照组的20-fold,同时其蛋白表达水平也是对照组的5倍多。而与此相反,VEGF表达水平,不论是mRNA表达还是蛋白质表达均在高糖刺激下明显下调。在高糖培基中孵育的MAPC细胞,其ERK1/2磷酸化水平明显上调,与此同时,STAT3在Tyr705残基而不是Ser727残基,磷酸化水平明显上调。通过ERK1/2上游MEK特效抑制剂PD98059以及U0126的抑制作用,ERK1/2磷酸化水平受到显著抑制,同时TGF-β1表达水平也受到抑制,而磷酸化STAT(Tyr705)水平得到恢复,VEGF表达也得到恢复而升高。利用AG490特效性阻断JAK2达到特效阻断磷酸化STAT3(Tyr705)的目的,VEGF表达下调,而TGF-β1表达上调,MAPC细胞ERK1/2磷酸化水平没有受到影响。以此说明STAT3在调控机制中的关键作用。结论高糖可以通过ERK1/2信号途径调抑制STAT(Tyr705)磷酸化水平,从而上调MAPC细胞TGF-β1表达,抑制VEGF表达。实验数据证明,对ERK1/2与STAT3信号通路的调控是维系MAPC细胞TGF-β1和VEGF表达平衡的关键。目的研究高糖对骨髓来源MAPC细胞周期转换的影响,及其可能的机制。方法分离纯化鼠骨髓细胞来源的MAPC细胞。该细胞孵育在普通培养基(含有5.5mM葡萄糖)以及高糖培养基(25.5mM葡萄糖)中,最长孵育14天。孵育在左旋葡萄糖培基中(20mM左旋葡萄糖+5.5mM葡萄糖)的MAPC细胞作为高渗透压培养的对照组,用于排除高渗对实验结果的干预。通过FACS(流式细胞仪)检测不同培养条件下MAPC细胞的周期变化。Western blot和免疫荧光被用于分析P21Waf1/Cip1和P27Kip1的表达水平。Smad磷酸化水平通过Western blot分析。应用ELISA和Q-RT-PCR反映TGF-β1在MAPC细胞中的表达。结果FACS结果显示,MAPC细胞的G1期延长,而S期缩短,G2期没有显著改变。Western blot以及免疫荧光显微成像结果都表明,细胞周期调控蛋白P2l Waf1/Cip1的表达水平在高糖刺激下升高,而P27Kip1的表达水平却没有改变。ELISA结果显示TGF-β1表达升高,利用TGF-β1抗体可以有效阻断TGF-β1表达。高糖在促进TGF-β1表达的同时,TGF-β2型受体的表达也随之增加。但TGF-β2型受体的表达会随时间而达到饱和。利用Western blot分析Smad2/3激活水平以及磷酸化CDK2表达水平。当TGF-β1抗体中和了TGF-β1,以及PD98059抑制了ERK1/2的磷酸化时,高糖介导的P21Waf1/Cip1表达增加,CDK2激活水平的提高,以及最终的MAPC细胞周期转换的阻滞,都将受到阻止而向相反的趋势发展。与此同时,ERK1/2磷酸化水平的变化可以发挥调控Smad信号途径的作用。结论高糖可以在G1/S期阻断早期分化阶段MAPC细胞的周期转换,其机制是通过TGF-β1介导ERK1/2言号激活,从而调控Smad和非Smad信号途径影响细胞周期调控抑制蛋白P21Waf1/Cip1的表达水平目的探讨糖对鼠骨髓来源MAPC细胞向内皮细胞或是平滑肌细胞分化趋势的影响方法复苏冻存的MAPC细胞,作为实验细胞来源。将MAPC细胞孵育在不同的条件培养基中：普通低糖培养基含有5.5mM葡萄糖；高糖培养基含有25.5mM葡萄糖；高渗培养基含有20mM左旋葡萄糖和5.5mM葡萄糖。MAPC细胞孵育在以上条件培养基中最多达14天。利用Q-RT-PCR分析特异性内皮标记物vWF、CD31以及Flkl的表达水平,同时也分析平滑肌标记物α-SMA和SM22-αmRNA水平。Western blot被用于分析以上三种内皮标记物以及平滑肌标记物的蛋白表达水平。结果在高糖的刺激下,Q-RT-PCR分析结果显示,vWF, CD31以及Flkl三种内皮特异性标记物mRNA表达水平降低。与此相反,通过TGF-β1抗体预处理MAPC细胞,阻断其分泌后,vWF、CD31和Flk1mRNA农达水平明显上调,与蛋纯高糖刺激存在明显差异。同时VVestern blot分析显示,高糖可以使以上三种内皮标记物表达高峰值延迟。在高糖条件下,α-SMA和SM22-α作为特异性平滑肌细胞标记物,其表达趋势与内皮特意性标记明显不同。α-SMA和SM22-α mRNA表达受到高糖刺激而升高；因高糖刺激而分泌增加的TGF-β1被TGF-β1抗体中和后,其表达水平受到显著抑制。结论高糖可以提升平滑肌标记物表达水平,同时抑制内皮细胞标记物表达水平。以上现象表明,高糖参与MAPC细胞分化趋势的调控,诱导MAPC细胞向平滑肌细胞方向分化,提示高糖可以干扰新生血管形成过程。