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目的：
构建由hTERT和HIF双向启动子调控的携带SEA基因的选择性增殖腺病毒,体外实验观察SEA基因在膀胱肿瘤细胞内的表达、刺激淋巴细胞相关细胞因子的分泌功能及其联合杀伤肿瘤细胞的作用。
方法：
将端粒酶启动子(hTERT)和缺氧诱导因子启动子(HIF)分别酶切、连接在缺陷型腺病毒的穿梭质粒的E1A和E1B序列前调控E1A和ElB蛋白的表达,CMV启动子和SV40调控目的基因SEA表达及终止,骨架质粒和穿梭质粒脂质体共同转染人胚肾293细胞进行同源重组获得双调控选择性复制性腺病毒H2-SEA-Ad,获取阳性空斑,提取腺病毒的DNA,进行PCR鉴定。扩增病毒,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测定病毒滴度。将以获取病毒转染膀胱肿瘤细胞E—J,RT—PCR检测SEA在肿瘤细胞内mRNA表达,免疫荧光定位SEA表达于肿瘤细胞,Western-b1ot测定蛋白表达,显微镜下动态观测淋巴细胞与肿瘤细胞共培养,MTT检测活细胞生长,ELISA检测IL-2、IL-4、TNF分泌。
结果：
应用PCR验证、双酶切分析、序列测定表明,成功构建穿梭质粒p315-CSS—SEA,通过同源重组成功获得携带超抗原SEA基因片段的H2-SEA-Ad腺病毒。RT—PCR检测SEA在肿瘤细胞内mRNA表达,琼脂糖电泳252bp处可见清晰条带；免疫荧光及Western-blot可见蛋白清晰表达；淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h实验组肿瘤细胞明显少于对照组；MTT检测实验组在12、24、48h活细胞数低于对照组；ELISA检测IL-2、IL-4、TNF分泌量实验组均高于对照组。
结论：
1、携带SEA基因的选择性腺病毒H2-SEA-Ad成功构建并表达目的基因。
2、初步验证对肿瘤细胞的杀伤作用。
3、初步验证刺激淋巴细胞相关因子分泌功能。