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β-木糖苷酶（β-xylosidase）是一种半纤维素酶,以外切的方式作用于低聚木糖非还原端产生木糖,还可作用于甾体、萜类等甙元与木糖形成的糖苷键,释放甙元。β-木糖苷酶在食品、饲料、制药及可再生能源等多个领域具有重要的应用价值,应用前景广阔。为了进一步提高嗜碱芽孢杆菌β-木糖苷酶BH3683的酶学性质,使其更好地适应工业生产的需要,本研究首先采用宏基因组区段改组的方法,对该酶进行了分子改造;设计和采用酶-金属离子杂化策略,实现了该酶的固定化;另外,构建了一种新型的枯草杆菌/大肠杆菌双表达载体,实现了该酶在两个表达系统中的高效表达。具体研究成果如下:首先,对来源于Bacillus halodurans C125的β-木糖苷酶基因BH3683进行了克隆,成功构建mEsprit-BH3683质粒,并在大肠杆菌表达,测定β-木糖苷酶的酶学性质。结果表明,该酶对底物p-NPX的米氏常数为1.23 mmol/L,最适反应温度为50℃,反应最适pH为8,在pH 6-10范围内保温30 min后剩余酶活力仍在50%以上,当温度超过50℃时,β-木糖苷酶热稳定性随温度升高急剧下降,部分金属离子、有机溶剂对该酶催化活性有较大抑制作用。第二,将5种不同来源的土样混合经木糖富集后提取总DNA,分析土壤微生物多样性发现土壤中微生物较为丰富,且经低聚木糖富集后不同种类微生物丰富程度发生了改变。根据数据库不同来源β-木糖苷酶序列设计了一对简并引物,扩增土壤中β-木糖苷酶基因同源区段,实现β-木糖苷酶宏基因组区段改组。本研究发现了一条成功改组且具有β-木糖苷酶活性的序列,命名为Xyl-M56,β-木糖苷酶Xyl-M56的最适温度为40℃,最适反应pH为7,较β-木糖苷酶BH3683向右发生了偏移,但是稳定性略有提高,在60℃条件下保温30 min后仍具有活性,6-12范围内pH耐受性整体较BH3683增强,相比于BH3683,Xyl-M56对有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮、丁醇的耐受性显著增强。第三,本研究构建了一种能够进行无背景克隆并在大肠杆菌和枯草杆菌中都能进行蛋白表达和纯化的质粒载体,同时具有T7启动子和Pspec启动子,以及经过改造的RBS,可以启动蛋白在大肠杆菌和枯草杆菌中进行有效的表达。该质粒含有一个在枯草杆菌和大肠杆菌中都有功能的氯霉素抗性基因。此外,该质粒还有一个CcdB表达框,可以编码CcdB毒蛋白,作为负筛选标记可以实现无背景克隆。并将木聚糖酶基因XynⅡ、β-木糖苷酶基因BH3683亚克隆到该载体上进行验证,结果表明该质粒可分别在大肠杆菌可枯草杆菌中复制和表达,而且XynⅡ和BH3683在两种表达系统中都得到表达。最后,为了使β-木糖苷酶BH3683更适应于工业生产的需要,本研究采用酶-金属离子杂化固定化的方法,对β-木糖苷酶进行固定化研究,对比固定酶与游离酶酶学性质的差异,研究结果表明固定酶的最适pH为7,最适温度在50℃-55℃,固定后酶在高温下温度稳定性明显优于游离酶,其部分金属离子耐受性,有机溶剂耐受性都较游离酶有了很大提高。