胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，每年在全世界有近百万新发病例、七十多万死亡病例，中国、日本等东亚国家为胃癌的高发地区。我国的胃癌发病例数占全世界胃癌发病例数的42.6%，死亡例数占45%。胃癌一般发现较晚，恶性程度高，预后不良。胃癌的发生发展进程与胃癌免疫抑制微环境密切相关，并减弱了胃癌患者的治疗效果。　　肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、基质细胞和多种免疫细胞组成。调节性T细胞（Treg）是人体免疫中发挥免疫抑制作用的主要细胞群，在胃癌等多种实体肿瘤中浸润增加，是组成免疫抑制性肿瘤微环境的主力。目前已知的大多数对外周血或肿瘤浸润Treg细胞的数据描述的都是CD4+CD25+Foxp3+T细胞，但在人胃癌中Treg细胞亚群的表型、调控、功能和临床相关性的研究却很少。我们发现胃癌中 Treg 细胞可以根据表面CD45RA和CCR7的表达分成不同的亚群，且CD45RA-CCR7-Treg细胞在胃癌肿瘤组织浸润增加，但其在胃癌组织中的具体分布、表型、抑制能力、调控分化机制等等尚不清楚。　　研究目的:　　1. 明确胃癌微环境中Treg细胞亚群的表型特征及分布；　　2. 研究胃癌微环境调控Treg细胞亚群分化的机制；　　3. 明确Treg细胞亚群在胃癌微环境中发挥的作用及机制；　　4. 通过体内模型验证Treg细胞亚群在肿瘤进展中的作用，并分析其临床意义。　　研究方法:　　1. 胃癌微环境中Treg细胞亚群的表型特征及分布　　从陆军军医大学附属西南医院普外科手术室取得新鲜的胃癌患者胃癌组织标本（包括胃癌组织、癌旁组织（距离胃癌边缘 3-4 cm）、非肿瘤正常组织（距离胃癌边缘5 cm及以外的组织））及外周血共72例，健康成人外周血45例作为对照；通过酶消化法与机械消化结合的办法获得单细胞悬液，进行流式抗体染色后，通过流式细胞仪检测Treg细胞表型，区分其亚型并进行统计分析。　　2. 胃癌微环境对CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群分化的调控及机制　　分选健康成人外周血中的CD4+T淋巴细胞，经抗CD3和CD28单克隆抗体激活，加入rhIL-2和TGF-β诱导分化，通过流式分选获得CD4+CD25+Treg细胞。　　用肿瘤组织培养上清（TTCS）和非肿瘤正常组织培养上清（NTCS）刺激体外诱导分化的Treg细胞24 h后，流式细胞术检测其亚型和频率。　　分选体外诱导分化的Treg细胞，用重组人细胞因子TNF-α刺激Treg细胞24 小时，收集细胞用于流式染色，分析 Treg细胞的表型。或者用 TTCS 加入 TNF-α中和抗体以及NTCS加入rhTNF-α刺激Treg细胞，通过流式细胞术检测其亚群分化的变化。　　用组织蛋白裂解液提取胃癌组织及相应的正常组织蛋白，同时收集NTCS和TTCS，检测TNF-α的浓度，并分析TNF-α的浓度和Treg细胞亚群频率及数量的相关性。　　分选体外诱导分化的Treg细胞，分别用信号通路阻断剂（SB203580、FLLL32、Wortmannin、SP600125、BAY11-7082）处理1 h后，加入TTCS刺激24小时，通过流式细胞术检测亚群分化，通过WB检测信号通路的激活。　　3. CD45RA-CCR7- Treg 细胞亚群在胃癌微环境中发挥的功能及机制的体外实验研究　　向体外诱导分化的Treg细胞，加入TTCS刺激24小时后分选CD45RA-CCR7-、CD45RA-CCR7+、CD45RA+CCR7-的Treg亚群，按1:1的比例与CFSE标记的CD8+T细胞共培养，加或不加anti-IL-10抗体，或者通过transwell小室使两种细胞接触或者不接触，5天后收集细胞进行流式细胞染色，检测CD8+ T细胞的增殖及GrB、IFN-γ的产生。　　4. 体内验证 CD45RA-CCR7- Treg 细胞亚群在肿瘤进展中的作用，并分析CD45RA-CCR7-Treg细胞的临床意义　　构建小鼠胃癌移植瘤模型（向 NOD/SCID 小鼠皮下注射 1×106 个胃癌细胞系SGC-7901细胞）。磁珠分选CD4+T细胞，通过TGF-β诱导5天待其分化为Treg细胞，通过流式分选CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞，用50%TTCS刺激24小时后，在加或不加anti-IL-10抗体或control IgG抗体的条件下，按照1：1的比例与CD8+T细胞共培养24小时，收集细胞。在皮下注射胃癌细胞的移植瘤模型构建第10天时，通过腹腔注射法将每种细胞 106单独或者同时注射入小鼠体内。每隔一天称量小鼠体重，并用游标卡尺测量移植瘤大小，至腹腔注射细胞第19天断颈处死小鼠，剥离出移植瘤，测量大小并拍照；取部分移植瘤冻存于液氮或用多聚甲醛固定，分别用于提取蛋白、RNA，或者用于石蜡包埋切片进行免疫组织化学染色；取小鼠脾脏检测IFN-γ+ CD8+ T细胞免疫应答情况。　　统计临床随访信息，分析胃癌组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群与临床指标的相关性，及CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群与患者预后和生存率的相关性。　　研究结果:　　1. 胃癌微环境中Treg细胞亚群的表型特征及分布　　1.1. Treg细胞分布情况　　胃癌患者外周血中CD3+CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞占CD4+ T细胞的百分率显著高于正常成人（p<0.01）。胃癌患者非肿瘤正常组织中 Treg 细胞百分率显著高于外周血（p<0.05），胃癌组织中浸润的 Treg 细胞百分率显著高于非肿瘤正常组织和癌旁组织（p<0.01）。　　1.2. Treg细胞表面标志及亚型分析　　流式细胞术结果显示，胃癌微环境中Treg细胞的表型特征有以下特点：与非肿瘤正常组织相比，大部分肿瘤浸润的Foxp3+Treg细胞为CD45RA-的记忆型T细胞表型，同时，大部分肿瘤浸润的 Foxp3+ Treg细胞低表达归巢分子 CCR7。分析 CD45RA和CCR7 两种表面标志的共表达情况，发现相比较非肿瘤正常组织，肿瘤组织中浸润的CD45RA-CCR7-表型的效应记忆性 Treg 细胞较多，而 CD45RA-CCR7+的中心记忆性Treg细胞较少。综合所有标本分析，发现CD45RA-CCR7-的效应记忆性表型Treg细胞在肿瘤组织的比例显著高于癌旁组织、非肿瘤正常组织及外周血。以上结果说明，胃癌肿瘤组织中浸润的Treg细胞主要为CD45RA-CCR7-的效应记忆性表型。　　2. 胃癌微环境对CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群分化的调控及机制　　2.1. 胃癌微环境来源的TNF-α诱导Treg细胞亚群分化　　与培养基及NTCS相比，TTCS能够刺激Treg细胞向CD45RA-CCR7-的效应记忆性表型分化，提示肿瘤微环境中存在某些因子能够显著诱导Treg细胞表型变化。与非肿瘤正常组织相比，肿瘤组织高表达促炎因子 TNF-α（p<0.01），并且 TNF-α 浓度与肿瘤组织中浸润的CD45RA-CCR7-表型Treg细胞的百分率呈显著的正相关（p<0.05），而与肿瘤组织中浸润的 CD45RA-CCR7+表型 Treg 细胞的百分率呈显著的负相关（p<0.05）。提示，肿瘤微环境中TNF-α调节Treg细胞表面CCR7的表达。重组人TNF-α可以有效降低Treg细胞表面CCR7的表达，致CD45RA-CCR7-表型Treg细胞百分率增加；anti-TNF-α的中和抗体加入可以有效抑制 TTCS对 Treg细胞分化的促进作用，而重组人 TNF-α 的加入可以加强 NTCS 对 Treg 细胞分化的促进作用，使CD45RA-CCR7-表型 Treg 细胞百分率增加。提示，胃癌肿瘤组织来源的 TNF-α 诱导Treg细胞CD45RA-CCR7-表型分化。　　2.2. TNF-α诱导Treg细胞亚群分化时激活STAT3信号通路　　STAT3信号通路抑制剂FLLL32的处理可以有效抑制TTCS促进CD45RA-CCR7-表型Treg细胞百分率增加及CD45RA-CCR7+表型Treg细胞百分率减少的作用，并且该作用呈现明显的剂量依赖性。TTCS刺激Treg细胞表型分化过程中，STAT3磷酸化增强，这一作用可以被anti-TNF-α中和抗体抑制；同样，加入STAT3信号通路抑制剂FLLL32也会有效抑制 STAT3的磷酸化。提示，肿瘤来源的TNF-α诱导 Treg细胞胞内 STAT3 磷酸化增强，促进 CD45RA-CCR7- Treg 细胞分化增加，并抑制了CD45RA-CCR7-Treg细胞表面HLA-DR的表达。　　3. Treg细胞亚群在胃癌微环境中发挥的功能及机制　　与CD45RA+CCR7-Treg细胞和CD45RA-CCR7+ Treg细胞相比，CD45RA-CCR7-Treg细胞表达HLA-DR、CD80和CD86的强度都较低。在混合淋巴细胞反应实验中，与CD45RA+CCR7-Treg细胞和CD45RA-CCR7+ Treg细胞相比，CD45RA-CCR7- Treg细胞抑制CD8+T细胞增殖的能力最强（p<0.01），抑制CD8+T细胞产生IFN-γ和GrB的能力也最强（p<0.05，p<0.01）。　　并且，该抑制作用可以通过在共培养体系中加入 anti-IL-10 中和抗体或隔离开CD45RA-CCR7- Treg细胞和CD8+ T细胞直接接触而减轻。提示CD45RA-CCR7- Treg细胞的抑制能力最强，且通过分泌IL-10或细胞-细胞直接接触发挥免疫抑制作用。　　4. 体内验证Treg细胞亚群在肿瘤进展中的作用，并分析其临床意义　　4.1.在NOD/SCID小鼠荷瘤模型中，与对照组（注射PBS缓冲液）相比，注射CD8+T 细胞组肿瘤生长缓慢瘤体较小，说明注射 CD8+ T 细胞能够有效抑制胃癌细胞系SGC7901的生长，CD8+T细胞有明确的抗肿瘤作用；与注射CD8+T细胞组相比，同时注射CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞组瘤体生长较快且瘤体体积较大，说明 CD45RA-CCR7- Treg 细胞显著抑制 CD8+ T 细胞的抗肿瘤作用。与注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞组相比，分别注射CD45RA-CCR7-Treg细胞与 CD8+ T 细胞（未共培养）组肿瘤生长缓慢且瘤体体积较小。与注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞加control IgG组相比，注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞加anti-IL-10阻断抗体组肿瘤生长缓慢且瘤体体积较小。提示我们，CD45RA-CCR7- Treg细胞抑制CD8+ T细胞的抗肿瘤效应，这种抑制作用可以通过 anti-IL-10 阻断抗体，或者隔离开 CD45RA-CCR7- Treg 细胞和CD8+T细胞互相接触，来有效的避免。从体内证明了CD45RA-CCR7-Treg细胞对CD8+T细胞发挥免疫抑制作用并验证了其发挥效应的机制。　　4.2.检测小鼠脾脏中IFN-γ+CD8+ T细胞的应答情况，发现单纯注射CD8+ T细胞组小鼠脾脏IFN-γ+T细胞的百分率显著高于注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞组，提示CD45RA-CCR7-Treg细胞对CD8+T细胞的抑制作用。注射未预先共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞组小鼠脾脏检测到IFN-γ+T cell的百分率显著高于注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞组（p<0.05）；注射共培养的CD45RA-CCR7- Treg细胞与CD8+ T细胞加anti-IL-10阻断抗体组小鼠的脾脏检测到IFN-γ+T cell的百分率显著高于加control IgG组（p<0.01）。提示， CD45RA-CCR7-Treg细胞对CD8+ T细胞的抑制作用是通过分泌IL-10和细胞-细胞接触方式实现的。　　4.3.通过免疫组织化学染色检测小鼠移植瘤的增殖和CD8+ T细胞在瘤体的浸润，发现：单纯注射CD8+ T细胞组比注射共培养的CD45RA-CCR7- Treg细胞与CD8+ T细胞组小鼠肿瘤PCNA表达含量低，且CD8+T细胞浸润多，提示CD45RA-CCR7-Treg细胞通过抑制 CD8+ T 细胞的浸润促进肿瘤细胞增殖。而注射未预先共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+ T细胞组小鼠比注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与 CD8+ T 细胞组小鼠移植瘤 PCNA 表达低，且 CD8+ T 细胞浸润多，提示CD45RA-CCR7-Treg细胞通过细胞-细胞接触抑制CD8+T细胞功能，促进肿瘤细胞增殖。注射共培养的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞加anti-IL-10阻断抗体组小鼠比加control IgG组小鼠移植瘤PCNA表达低，且CD8+T细胞浸润多，提示CD45RA-CCR7-Treg细胞通过分泌IL-10抑制CD8+ T细胞的浸润促进肿瘤细胞增殖。以上结果说明，CD45RA-CCR7-Treg细胞通过细胞-细胞接触和分泌IL-10抑制CD8+T细胞的抗肿瘤效应。　　4.4.临床相关性分析显示，肿瘤组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞的百分率的增高与肿瘤临床分期、肿瘤大小、淋巴管侵袭情况相关。根据胃癌患者肿瘤组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞百分率的中位数将患者分为高浸润组（≥91.3%）或低浸润组（<91.3%），统计发现CD45RA-CCR7-Treg细胞高浸润组患者的30个月总体生存率显著低于低浸润组（p<0.05）。对肿瘤组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞绝对数进行分析得到同样结论。此外，分析发现肿瘤组织中浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞百分率与 CD8+ T 细胞百分率成显著负相关关系（ p<0.05 ）。根据肿瘤组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+ T细胞比值的中位数将患者分为高比值组（≥1.289）或低比值组（<1.289），统计患者30月总体生存率，发现肿瘤组织浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞与CD8+T细胞高比值组的总体生存率显著低于低比值组（p<0.01）。　　结论:　　1. 胃癌肿瘤微环境中有大量 Treg 细胞浸润，主要表现为 CD45RA-CCR7-效应记忆性表型。　　2. 胃癌微环境来源的TNF-α通过激活STAT3信号通路调节Treg细胞，促进其向CD45RA-CCR7-效应记忆性表型分化。　　3. 胃癌肿瘤微环境中CD45RA-CCR7-效应记忆性Treg细胞亚群通过分泌IL-10及细胞-细胞接触机制发挥对效应细胞的免疫抑制作用，从而促进胃癌进展。　　4. CD45RA-CCR7-Treg细胞百分比和绝对数与胃癌进展密切相关，同时CD45RA-CCR7- Treg细胞与CD8+ T细胞比值也与胃癌进展相关，可以作为预测患者的总体生存率的指标。　　意义　　本研究关注胃癌微环境中浸润的CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群，表现为效应记忆性表型。CD45RA-CCR7-Treg细胞亚群可以作为判断胃癌微环境状态的指标，在胃癌免疫治疗中，通过靶向CD45RA-CCR7- Treg细胞亚群，特异性耗竭Treg细胞，可以作为免疫治疗的新思路。