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苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）能产生多种不同的晶体蛋白毒素Cry,这些毒素被广泛用于害虫防治。Cry蛋白质在转基因植物中的高水平表达有效地保护了植物不被害虫破坏。Cry毒素具有较高的特异性,与昆虫中肠刷状缘膜上特异的受体如氨基肽酶N（amino peptidaseN,APN）、碱性磷酸酶（alkaline phosphalase,ALP）、钙粘蛋白（cadherin,CAD）和 ABC转运蛋白（ABCC2）等相互作用。Cry毒素受体在与毒素结合、诱导毒素寡聚化、插入膜和形成孔洞的过程中起着重要的作用,最终导致昆虫中肠细胞裂解和幼虫死亡。CAD受体由三个结构域组成:细胞外结构域、单次跨膜结构域（TM）和胞质结构域（CPD）。细胞外区域由近膜区域（MP）和11-12个参与Ca2+ 结合的钙粘蛋白重复序列（CR）组成。研究表明,棉铃虫CAD（HaCAD）的CR10-11含有与Cry1Ac毒素相互作用的毒素结合区（TB）。通过位点定向突变（包括截短或删除蛋白质的某些结构域）研究了 CAD各结构域在介导Cry1Ac毒力过程中的作用。CAD的TB结构域通过促进毒素寡聚化在介导Cry毒素毒力方面发挥了重要作用,其他CR区对Cry毒力不是必要的。例如,一个HaCAD突变体,其中前9个CR被删除,仍然能够介导Cry1Ac对表达有该突变体的Sf9细胞的毒力,毒力大小类似于完整HaCAD蛋白介导的Cry1Ac的毒力。关于MP区域,有证据表明它不涉及Cry1Ac毒力,因为仅包含TB区域的CAD片段或来自MsCAD的CR12仍然能够增强Cry1Ac对不同昆虫幼虫的毒力。最后,CPD的作用是有争议的,据报道,与完整的HaCAD相比,在HaCAD中去除该区域导致Sf9细胞对Cry1Ac敏感性的轻微降低,但也是有显著性差异的。然而,另一个小组采用BmCAD的研究结果不同,该区域的缺失仍然能够赋予Sf9细胞对Cry1Ac和Cry1Ab的敏感性,并且缺失突变体与ABCC2仍能协同作用增强Cry1Ac毒力,效果类似于完整的BmCAD与ABCC2的增效作用。ABCC2与Cry毒素的结合具有两种作用,即促进毒素的寡聚化和将寡聚物插入到幼虫中肠细胞膜中形成孔洞。研究表明,家蚕的CAD和ABCC2在Sf9细胞中的共表达对Cry1Ac毒力有增强作用,这两种受体存在时的毒力比仅表达BmABCC2的细胞高出100倍。有关其他鳞翅目昆虫物种的CAD和ABCC2受体的协同作用也有类似的报道。上述有关CAD与ABCC2协同作用的研究尚不够系统,而且存在争议。目前尚需进一步进行深入探索。本研究采用一种新的实验体系（构建嵌合体CAD蛋白）详细研究了棉铃虫CAD参与ABCC2协同作用而增强Cry1Ac毒素毒力的关键区域,具体结果如下:首先,明确了 HaCAD与HaABCC2共表达对Cry1Ac毒素毒力的协同增效作用。棉铃虫CAD（HaCAD-GFP）的单表达诱导了 Hi5细胞对Cry1Ac的敏感性,并在与棉铃虫ABCC2（HaABCC2-GFP）共表达时增强了 Cry1Ac毒力。在Hi5细胞中共表达时Cry1Ac毒力比单独表达HaCAD-GFP增加了 735倍,比单独表达HaABCC2-GFP增加了 28倍。其次,为了确定CAD参与ABCC2协同作用而增强Bt毒素Cry1Ac毒力的关键区域,构建并表达了不同截短的CAD。在单表达HaCAD的Hi5细胞中,CR4-6和CR7-9的缺失显著降低了 Cry1Ac的细胞毒力;TB和MP是HaCAD介导的Cry1Ac细胞毒力所必需的;而CPD的缺失对Cry1Ac的细胞毒力影响不显著。与HaABCC2-GFP共表达时,CR4-6和CR7-9的缺失使Cry1Ac的毒力相对于单表达HaABCC2-GFP增加4.67倍;TB和MP的缺失使Cry1Ac的细胞毒力相对于单表达HaABCC-GFP没有增加,提示HaCAD的TB和MP可能参与了 Cry1Ac的细胞毒力,这两个结构域对于CAD和ABCC2协同作用可能是必需的。CPD的缺失使Cry1Ac的毒力相对于单表达HaABCC2-GFP增加14倍。除CPD缺失体外,其他HaCAD结构域的缺失突变体都显著减少了 CAD在细胞膜上的表达。第三,在上述研究中,为了消除上述缺失体蛋白质定位变化对Cry1Ac细胞毒力的影响,构建了不同的CAD嵌合体并进行了离体生测。HaCAD-GFP能够介导Cry1Ac对Hi5细胞的毒力,而斜纹夜蛾CAD（SlCAD-GFP）不能介导Hi5细胞对Cry1Ac毒素的敏感性。棉铃虫CAD（HaCAD-GFP）与棉铃虫ABCC2（HaABCC2-GFP）共表达后,Cry1Ac对Hi5细胞毒力增强。相比之下,在Hi5细胞中表达的斜纹夜蛾CAD（SlCAD-GFP）不能增强HaABCC2-GFP介导的Cry1Ac的毒力。在SlCAD-GFP和HaCAD-GFP蛋白之间替换CAD的不同结构域,并在HaABCC2-GFP缺失或存在的情况下对Hi5细胞进行细胞毒力试验测定。这种替换并没有改变嵌合体钙黏蛋白的亚细胞定位。荧光显微镜观察表明,不同的CAD嵌合体蛋白均在细胞膜上分布。细胞毒力分析表明,在单表达HaCAD-GFP嵌合体的Hi5细胞中,HaCAD的TB与MP或TM是介导Cry1Ac毒力的必要结构域。然而在共表达HaCAD-GFP嵌合体和HaABCC2-GFP的Hi5细胞中,HaCAD毒素结合区（TB）,特别是TB的CR-11,是HaCAD与ABCC2协同作用增强Bt毒素Cry1Ac毒力必要的结构域。最后,体外配体结合实验表明,细菌表达的HaCAD的TB片段能够与Cry1Ac毒素结合,而SlCAD的TB不能与Cry1Ac毒素结合。HaCAD的TB片段与Cry1Ac毒素的混合物对表达HaCAD-GFP的细胞没有毒力,对单表达HaABCC2-GFP或共表达HaCAD-GFP和HaABCC2-GFP的细胞的毒力没有下降。细菌表达的HaCAD的TB结构域片段能增强Cry1Ac对棉铃虫幼虫的毒力。基于上述研究结果和已有的文献报道,我们提出了一种新的模型,CAD的TB结构域参与招募毒素单体使其寡聚化（但不能插入）,并定位于与ABCC2相互作用的良好位置,从而使寡聚体毒素能更有效的传递给ABCC2并插入细胞膜,增强Cry1Ac的毒力。该模型丰富了 CAD与ABCC2协同增效作用的理论。