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本试验通过采用金葡菌Newbould305建立了小鼠泌乳期乳腺内感染的乳腺炎动物模型,并在此基础上探讨牛源性重组金葡菌β-溶血素(P-hemolysin,β-HL)亚单位疫苗对小鼠乳腺局部、整体的防御体系及炎症相关因子的影响,为乳腺炎的生物防治提供新思路。1.牛源性金葡菌攻击下小鼠泌乳期感染模型的建立选择48只未孕雌鼠随机分为6组(n=8),产后7-10d分别在小鼠的第四对乳腺内灌注经过毒力活化的细菌悬液5.0×10~2CFU/50μL (E1)、1.0×10~3CFU/50μL (E2)、5.0×10~3CFU/50μL (E3)、1.0×10~4CFU/50μL (E4)和1.0×10~5CFU/50μL (E5),对照组小鼠乳腺内注入同剂量的无菌的PBS,48h处死。观察小鼠乳腺组织中细菌数量、TNF-α、IL-2和IL-6含量的变化及乳腺组织形态学观察。结果表明实验组乳腺组织中分离到细菌数呈现先升高后下降的趋势,E3达到最高。组织形态学上对照组腺泡结构完整, E1组和E2组腺泡内主要以浆液性渗出为主,E3组腺泡壁增厚,腺泡腔内嗜中性粒细胞(PMN)增多,随着剂量的增大E4和E5组腺泡壁破裂,甚至个别样品出现坏死灶。与对照组相比,E3组小鼠乳腺组织中TNF-α、IL-2和IL-6含量极显著升高(P<0.01),整体来看呈先升高后下降的趋势。由结果可知5.0×10~3CFU/50μl(E3)剂量下的金葡菌攻击下的小鼠乳腺炎性反应与炎症的免疫病理过程一致,故选择此剂量作为小鼠乳腺内感染的病理模型的造模剂量。2.重组金葡菌p-溶血素亚单位疫苗对小鼠金葡菌性乳腺炎的保护效果研究48只雌鼠随机分成对照组、造模组、pET-32a(+)质粒蛋白免疫不攻毒组、pET-32a(+)质粒蛋白免疫攻毒组、β-HL免疫不攻毒组、β-HL免疫攻毒组(n=8),用Ni-NTA Agarose纯化目的蛋白,Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定,无菌将蛋白制作成疫苗免疫小鼠。产后7-10天分别在小鼠的第四对乳腺内灌注经过毒力活化的细菌悬液5.0×10~3CFU/50μL,用ELISA方法测定抗体效价,并分离攻毒后小鼠乳腺中细菌、观察乳腺匀浆中细胞因子的含量变化及通过琼脂糖免疫双向扩散试验观察pET-32a(+)载体对金葡菌重组β-溶血素的影响。结果表明纯化的β-HL和pET-32a (+)质粒蛋白分别在57kD和20.5kD处显示单一条带,蛋白含量分别为950μg/ml和1.45mg/ml;β-HL重组蛋白和pET-32a(+)质粒蛋白免疫小鼠都能产生相应的抗体,随着免疫次数的增加,产生的相应抗体滴度也逐渐增加；pET-32a(+)免疫攻毒组和β-HL免疫攻毒组乳腺匀浆中的TNF-α和IL-2的含量与空白攻毒组相比有所变化,但差异不显著(P>0.05),之间不存在统计学意义,但与各自相应对照组之间存在统计学意义。而pET-32a(+)免疫攻毒组乳腺匀浆中的IL-6含量与空白攻毒组之间,二者存在统计学意义(P<0.05),而p-HL免疫攻毒组则变化不大；通过琼脂糖免疫双向扩散试验,抗重组β-HL抗体和抗pET-32a(+)载体蛋白的抗体都与金葡菌Newbould305超声波破碎液形成沉淀线。由结果可知纯化的目的蛋白达到电泳级纯度；蛋白疫苗作用机体能够产生较高的抗体水平；pET-32a(+)质粒蛋白可以增加β-HL蛋白的抗原性。总之,金葡菌重组β-溶血素亚单位疫苗对由金葡菌菌株Newbould305诱导的乳腺炎并不能减轻小鼠乳腺的炎症状态,但一定程度上能够减少小鼠乳腺内细菌的数量。