论文部分内容阅读
抗菌肽(Antibacterial peptides)是天然免疫的主要成分,对细菌、真菌、病毒、酵母甚至癌细胞都具有杀伤作用,具有广谱性、高效性、选择毒性、稳定性及不易产生抗药性等特点,自发现和研究至今被认为是现有抗生素的最佳替代品,其研究及应用已成为生物制药领域中的热点。从L.Aurea和L.raniformis中分离得到的aurein家族具有光谱抗癌活力,Aurein1.2、3.2和3.3的抗癌活性最高,大约对人体90%的癌细胞都有中等程度抗性,在100ug/mL的浓度下对红细胞无杀伤作用。其中Aurein1.2是目前为止报道的具有抗菌及抗癌作用的最小的α螺旋结构抗菌肽,肽链中央两亲性仅一螺旋结构与其活性密切相关,其氨基酸序列为GLFDIIKKIAESF,研究发现其对人体包括结肠癌、乳腺癌、肺癌等在内的55种癌症有活性。
高生产成本是阻碍抗菌肽大规模临床应用的最首要的问题,现有的抗菌肽价格大约为50-400美元每克,这对于大多数人都难以负担,因此急需建立商业化生产平台。很多研究者在致力于解决生产成本的问题,合成法生产抗菌肽时,减少肽的大小十分重要,很多药业公司开始寻找更小的抗菌肽。运用基因工程手段,在微生物中进行重组表达是减少成本的另一个选择。
本课题根据报道的Aurein1.2氨基酸序列和酵母的密码子偏好性,设计了两条引物经重叠片段PCR法获得目的基因。将目的基因与粟酒酵母载体pESP-2质粒重组构建融合表达质粒,醋酸锂方法转化粟酒酵母宿主菌,在摇瓶中实现融合蛋白的高效、稳定表达。培养菌经细胞破碎、亲和层析纯化到单一的目的蛋白,经蛋白酶切和Western bloting验证,证实了小分子抗癌肽Aurein1.2在粟酒裂殖酵母中的高效表达。